酿酒酵母代谢工程菌的构及代谢工程研.docx
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酿酒酵母代谢工程菌的构及代谢工程研
4500rpm离心10min后收集菌体沉淀,真空干燥,500ml
图1ATCC58785基因组提取结果
进行基因组提取。
(2)
PCF扩增程序为:
94C
4min
94C
30S
61C
30S20
72C
60S
72C
10min
4C
保存
个循环
1木糖还原酶编码序列(XYL1F)的克隆转化
1.1ATCC58785树干毕赤酵母基因组的提取
1.1.1菌体干粉的制备
将培养20h的树干毕赤酵母于发酵液约得到1.3g干燥菌粉。
1.1.2基因组的提取
采用OMEGAFungalDNAMiniKit
1.1.3电泳检测
1:
入-Hind川digest(3.5uL)
2:
21mg菌粉提取的基因组(5uL)3:
31mg菌粉提取得基因组(5uL)
1.2XYL1基因的PCR扩增
1.2.1第一次PCR
(1)反应体系
TemplateDNA2.0ul10Xbuffer5.0ul
MgCl2(25mmol/L)6.0ul
X1-primer1(25umol/L)1.0ulX1-primer2(25umol/L)1.0uldNTP(2mmol/L)4.0ul
Taq酶(5u/L)1.0ul
灭菌超纯水补齐至50ul
End
(3)电泳检测
1:
100bpDNAladder(3.5uL)
2:
100bpDNAladder(3.5uL)
3:
21mg菌粉提取得基因组作为模版(5uL)
4:
31mg菌粉提取得基因组作为模版(5uL)
5:
31mg菌粉提取的基因组作为模版(5uL)PCR扩增失败。
1.2.2Tm值的摸索
(1)反应体系
TemplateDNA1.0ul
10Xbuffer2.0ul
MgCI2(25mmol/L)1.5ul
X1-primer1(25umoI/L)0.5ul
X1-primer2(25umoI/L)0.5ul
dNTP(2mmol/L)
Taq酶(5u/L)
2.0ul
0.5ul
火菌超纯水
补齐至20ul
(2)PORT增程序为:
94C4min
94C30S
52〜62C50S
30
A个循环
72C90S
72°C10min
4C保存
End
(3)电泳检测
上1:
100bpDNAladder(1.5uL)
上2:
PCRTm为52.3C(10ul)
上3:
PCRTm为53.7C(10ul)
上4:
PCRTm为54.8C(10ul)
上5:
PCRTm为53.7C(10ul)
上6:
PCRTm为52.3C(10ul)
下1:
100bpDNAladder(1.5uL)
下2:
PCRTm为56.3C(10ul)
下3:
PCRTm为58.0C(10ul)
下4:
PCRTm为59.4C(10ul)
下5:
PCRTm为61.3C(10ul)
下6:
PCRTm为62.0C(10ul)
所以选52.3C为XYL1PCR扩增时的退火温度。
1.2.3XYL1的PCR扩增
(1)反应体系
1反应体系1
图3XYL1PCR中Tm摸索结果
TemplateDNA2.5ul
10Xbuffer5.0ul
MgCl2(25mmol/L)3.75ul
X1-primer1(25umol/L)1.25ul
X1-primer2(25umol/L)1.25uldNTP(2mmol/L)5.0ul
Taq酶(5u/L)1.2ul
灭菌超纯水补齐至50ul
2反应体系2
TemplateDNA2.5ul10Xbuffer5.0ul
MgCl2(25mmol/L)3.75ul
X1-primer1(25umol/L)0.5ul
X1-primer2(25umol/L)0.5ul
dNTP(2mmol/L)5.0ul
Taq酶(5u/L)1.25ul
灭菌超纯水补齐至50ul
3反应体系3
TemplateDNA2.0ul10Xbuffer5.0ul
MgCI2(25mmol/L)6.0ul
X1-primer1(25umol/L)1.0ul
X1-primer2(25umol/L)1.0ul
dNTP(2mmol/L)4.0ul
Taq酶(5u/L)1.0ul
灭菌超纯水补齐至50ul
(2)PCRT增程序为:
94°C4min
94C30S'
52.3C50S30»个循环
72C90S
72C10min
4C保存
End
(3)电泳检测
1:
100bpDNAladder(2.5uL)
2:
反应体系3(25ul)
3:
反应体系3(25ul)
4:
反应体系3(25ul)
反应体系1的扩增结果较好。
1234
图4XYL1的PCR扩增结果
1.3XYL1基因的凝胶回收
1.3.1凝胶回收
本次胶回收采用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行
1.3.2电泳检测
1:
100bpDNAladder(2.5uL)
2:
胶回收后的XYL1(5ul)
1.4XYL1与T质粒连接和转化
反应体系15ul
实验组
阳性对照
因性对照
2XRapidLigationBuffer
7.5
7.5
7.5
Pgem-TEasyVector
1.5
1.5
1.5
PCRProduct
4.5
—
—
ControlInsertDNA
—
3
—
ddH2O
—
1.5
4.5
T4DNALigase
1.5
1.5
1.5
图5XYL1的胶回收结果
3:
T质粒片段(5ng/ul,5ul)
1.5挑单斑提质粒
1
1kbpDNAladder
(5uL)
2
实验组白斑1(后称为T-X1①)
(5uL)
3
实验组白斑2(后称为T-X1②)
(5uL)
4
实验组蓝斑1(后称为T-1)
(5uL)
5
实验组蓝斑2(后称为T-2)
(5uL)
6
阳性对照组白斑(后称为T-3)(5uL)
7
阳性对照组蓝斑(后称为T-4)(5uL)
1.6EcoRI酶切
T-X1①T-X1②
T-1T-2
T-3
T-4
质粒
7.57.5
7.59
9
9
10xbuffer22
22
2
2
EcoRI
0.50.5
0.50.5
0.5
0.5
DdH2O1010
108.5
8.5
8.5
1
100bpDNAladder
(5uL)
2
T-X1◎(9uL)
3
T-X1笑(9uL)
4
T-1(9uL)
5
T-2(9uL)
6
T-3(9uL)
7
T-4(9uL)
8
1kbpDNAladder
(5uL)
1.7NdeI和SacH双酶切
质粒7.0ul
10Xbuffer2.0ul
SacH0.5ul
NdeI0.5ul
火菌超纯水补齐至20ul
1
1kbpDNAladder
(5uL)
2
T-X1◎(9uL)
3
T-X1笑(9uL)
4
100bpDNAladder
(5uL)
5
T-1(9uL)
6
T-2(9uL)
7
T-3(9uL)
8
T-4(9u2)
1.8PCR验证
(1)反应体系
TemplateDNA
1.0ul
10Xbuffer2.0ul
MgCI2(25mmol/L)1.5ul
M4(25umol/L)0.5uI
个循环
1234
567
RV(25umol/L)0.5ul
dNTP(2mmol/L)2.0ul
Taq酶(5u/L)0.5ul
(2)
PCRT增程序为:
94C
4min
94C
30S
45C
50S30
72C
90S
72C
10min
4C
保存
灭菌超纯水补齐至20ul
End
1:
T-X1F(D(6uL)
2:
T-X1F®(6uL)
3:
T-1(6uL)
4:
T-2(6uL)
5:
T-3(6uL)
6:
T-4(6u2)
7:
100bpDNAladder(5uL)
1.9测序
将T-X仆①和T-X仆②送样生工测序,经序列比对后,结果显示T-X仆①和T-X仆②基
因序列全正确。
2木糖还原酶(XYL1S)和木糖醇脱氢酶基因(XYL2S)的克隆转化
2.1ATCC58785树干毕赤酵母基因组的提取
2.1.1菌体干粉的制备
将培养20h的树干毕赤酵母于4500rpm离心10min后收集菌体沉淀,真空干燥,500ml
发酵液约得到1.3g干燥菌粉。
2.1.2基因组的提取
采用OMEGAFungalDNAMiniKit进行基因组提取。
2.1.3电泳检测
1:
基因组(4uL)
2:
入-Hind川digest(4uL)
2.2XYL1S和XYL2S的PCR扩增
(1)反应体系
TemplateDNA2.5ul
10Xbuffer5.0ul
MgCl2(25mmol/L)3.75ul
primerl(25umol/L)1.25ul
primer2(25umol/L)1.25ul
dNTP(2mmol/L)5.0ul
Taq酶(5u/L)1.25ul
(2)
PCRT增程序为:
94r
4min
94r
30S
52r
50S30
72r
90S
72r
10min
4r
保存
灭菌超纯水补齐至50ul
End
1:
100bpDNAladder(5uL)
2:
XR编码序列(36uL)
3:
XYL1基因(36uL)
4:
XYL2基因(36uL)
2.3XYL1S和XYL2S的凝胶回收
2.3.1凝胶回收
12345
本次胶回收采用QIAGEN胶回收试剂盒进行
2.3.2电泳检测
1:
100bpDNAladder(5uL)
2:
XR编码序列(4uL)
3:
XYL1基因(4uL)
4:
XYL2基因(4uL)
5:
T质粒片段(5ng/ul,5ul)
反应体系15ul
实验组
阳性对照
阴性对照
2>RapidLigationBuffer
7.5
7.5
7.5
Pgem-TEasyVector
1.5
1.5
1.5
PCRProduct
4.5
—
—
ControlInsertDNA
—
3
—
ddH2O
—
1.5
4.5
T4DNALigase
1.5
1.5
1.5
(1)反应体系
2.4XYL1S和XYL2S的连接和转化
(2)转化结果
T-XYL1F
T-XYL1S
T-XYL2S
Positivecontrol
Backgroundcontrol
白斑
59
71
37
174
48
蓝斑
20
0
0
3
7
2.5T-XYL1S和T-XYL2S的质粒提取
(1)质粒提取:
4
5
6
1000bpDNAladder(5uL)
T-XYL1S◎(4uL)
T-XYL1S笑(4uL)
T-XYL2S◎(4uL)
T-XYL2S笑(4uL)
T质粒(9uL)
(2)PCR鉴定:
33
1
2
3
4
5
6
100bpDNAladder(5uL)
T-XYL1S◎(9uL)
T-XYL1S笑(9uL)
T-XYL2S◎(9uL)
T-XYL2S笑(9uL)
T质粒(9uL)
1000bpDNAladder(5uL)
2.6T-XYL1S和T-XYL2S的酶切鉴定
T-XYL1S①
T-XYL1S②
T-XYL2S①
T-XYL2S②
质粒
2
2
2
2
10Xouffer
2
2
2
2
EcoRI
0.5
0.5
0.5
0.5
ddH2O
15.5
15.5
15.5
15.5
(1)EcoRI酶切
上1
T-XYL1S◎(10uL)
上2
T-XYL1S笑(10uL)
上3
T质粒(10uL)
上4
1kbpDNAladder(5uL)
上5
100bpDNAladder(5uL)
上6
T-XYL2S◎(10uL)
上7
T-XYI^S笑(10uL)
(2)NdeI和Sacn双酶切
质粒
10Xbuffer
SacH
Ndel
2.0ul
2.0ul
0.5ul
0.5ul
灭菌超纯水下下下
下4
下5
下6
T-XYL1S
T-XYL1S
T质粒(
补齐至20ul
◎(10uL)笑(10uL)10uL)
1kbpDNAladder(5uL)100bpDNAladder(5uL)T-XYL2S◎(10uL)
3
下7:
T-XYL2S笑(10uL)
2.7二次挑单斑提质粒
T-XYL2S3(4uL)
T-XYL2S4uL)
T-XYL2S⑤(4uL)
T-XYL2S®(4uL)
T-XYL2S炉(4uL)
T质粒(4uL)
lOOObpDNAladder(5uL)
2.8T-XYL2S的EcoRI酶切鉴定
123・4一5—67
T-XYL1S①
T-XYL1S④
T-XYL2S⑥
T-XYL2S⑦
质粒
2.5
2.5
2.5
2.5
10xbuffer
2
2
2
2
EcoRI
0.5
0.5
0.5
0.5
ddH2O
15
15.5
15.5
15.5
123456
1
100bpDNAladder(5uL)
2
T-XYL2S◎(10uL)
3
T-XYL2S10uL)
4
T-XYL2S®(10uL)
5
T-XYL2S炉(10uL)
6
1000bpDNAladder
(5uL)
2.9SphI和PstI双酶切
质粒
2.5ul
10buffer
2.0ul
SphI
0.7ul
PstI
1.5ul
火菌超纯水补齐至
20ul
1
100bpDNAladder(5uL)
2
T-XYL2S◎(10uL)
3
T-XYL2S笑(10uL)
4
T-XYL2S10uL)
5
T-XYL2S®(10uL)
6
T质粒(10uL)
7
T-XYL2S炉(10uL)
8
1000bpDNAladder
(5uL)
12345678
2.10送样测序
将T-XYL1S①、T-XYL1S②、T-XYL2S②、
样生工测序,经序列比对后确定T-XYL2S④中的
T-XYL2S④、T-XYL2S⑥和T-XYL2S⑦送
XYL2基因序列全正确。
3木糖醇脱氢酶编码序列(XYL2F)的克隆转化
3.1ATCC58785树干毕赤酵母基因组的提取
3.1.1菌体干粉的制备
将培养20h的树干毕赤酵母于4500rpm离心10min后收集菌体沉淀,真空■■发酵液约得到1.3g干燥菌粉。
3.1.2基因组的提取
采用OMEGAFungalDNAMiniKit进行基因组提取。
3.1.3电泳检测
1:
基因组(4uL)
2:
入-Hind川digest(4uL)
3.2XYL2F的PCR扩增
(1)反应体系
TemplateDNA2.5ul
10Xbuffer5.0ul
MgCI2(25mmol/L)3.75ul
primer1(25umol/L)1.25ul
primer2(25umol/L)1.25ul
dNTP(2mmol/L)5.0ul
Taq酶(5u/L)1.25ul
灭菌超纯水补齐至50ul
(2)PCF扩增程序为:
94°C5min
94C30S
49C50S35〉个循环
72C100S
-Z
72C10min
4C保存
End
1:
1OObpDNAladder(5uL)
2:
XYL2F基因Tm51(36uL)
3:
XYL2F基因Tm49(36uL)
4:
XYL2F基因Tm49(36uL)
3.3XYL1S和XYL2S的凝胶回收
3.3.1凝胶回收
本次胶回收采用QIAGEN胶回收试剂盒进行
3.3.2电泳检测
1:
200bpDNAladder(5uL)
2:
XDH编码序列(4uL)
3.4XYL2F的连接和转化
(1)反应体系
反应体系15ul
实验组
2>RapidLigationBuffer
7.5
Pgem-TEasyVector
1.5
PCRProduct
4.5
ControlInsertDNA
—
ddH2O
—
T4DNALigase
1.5
(2)转化结果
T-XYL2F
Positivecontrol
白斑
42
菌落较多
蓝斑
5
一
将提取的T-XYLIF质粒转化JM109作为阳性对照
3.5T-XYL2F的质粒提取
(1)质粒提取:
1:
T-XYL2F®(4uL)
2:
T-XYL2F®(4uL)
3:
1000bpDNAladder(5uL)
3.6T-XYL2F的酶切鉴定
T-XYL1S①
T-XYL1S④
T-XYL2S⑥
T-XYL2S⑦
质粒
2.5
2.5
2.5
2.5
10xbuffer
2
2
2
2
EcoRI
0.5
0.5
0.5
0.5
ddH2O
15
15.5
15.5
15.5
(1)EcoRI酶切鉴定
(2)SphI和PstI双酶切
质粒
2.5ul
10buffer
2.0ul
SphI
0.7ul
PstI
1.5ul
灭菌超纯水补齐至20ul
1:
T-XYL2F①的SphI和PstI双酶切(16uL)2:
T-XYL2F②的SphI和PstI双酶切(16uL)3:
T-XYL2F①的EcoRI酶切(16uL)
4:
T-XYL2F②的EcoRI酶切(16uL)
5:
100bpDNAladder(5uL)
6:
1000bpDNAladder(5uL)
3.7送样测序
将T-XYL2F①送样生工测序,经序列比对后确定
T-XYL2F①中的XDH编码序列全正
确。
4表达质粒的构建
4.1Y1F(Yep24+XYL1F)质粒的构建
4.1.1
Yep24和T-XYL1F①质粒的提取
1:
T-XYL1F①质粒(4uL)
2:
Yep24(4uL)
3:
1000bpDNAladder(5uL)
4.1.2SphI和BamHI双酶切
质粒7/10ul(T-XYL1F①7ul;Yep2410ul)
10buffer2.0ul
BamHI0.5ul
(1)酶切体系
SphI1.0ul
灭菌超纯水__补齐至20ul
1:
1000bpDNAladder(5uL)
2:
T-XYL1F©(20uL)
3:
Yep24(20uL)
(2)凝胶回收
1:
1000bpDNAladder(5uL)
2:
T-XYL1F©(20uL)
3:
Yep24(20uL)
4.1.3连接和转化
(1)连接体系
反应体系15ul
实验组
10xLigationBuffer
2.0
Yep24
16
X1F
1
T4DNALigase
1
(2)转化结果
Y1F
阳性对照
白斑
9
菌落较多
将提取的Yep24质粒转化JM109作为阳性对照
4.1.4Y1F的质粒提取
(1)质粒提取:
1:
1000bpDNAladder(5uL)
2:
Yep24
3:
Y1F©(4uL)
4:
丫仆笑(4uL)
5:
Y1F@(4uL)
6:
Y1F@(4uL)
4.15Y1F的鉴定
(1)XYL1F的PCR鉴定
反应体系
TemplateDNA2.5ul
10Xbuffer5.0ul
MgCI2(25mmol/L)3.75ul
primerl(25umol/L)1.25ul
primer2(25umol/L)1.25ul
dNTP(2mmol/L)5.0ul
Taq酶(5u/L)1.25ul
灭菌超纯水补齐至50ul
PCRT增程序为:
94°C4min
94C30S
59C50S30个循环
72C120S
72C10min
4C保存
End
(2)SphI和BamHI双酶切鉴定
质粒
2.5ul
10X)uffer
2.0ul
SphI
0.7ul
PstI
1.5ul
灭菌超纯水补齐至20ul
1:
1000bpDNAladder(5uL)2:
Yep24的PCR产物(4uL)3:
Y仆①的PCR产物(4uL)4:
Y仆②
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- 酿酒 酵母 代谢 工程