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thanks心血宁颗粒质量标准的研究
题目:
心血宁颗粒质量标准的研究
院(系)药学院
专业中药学
年级2003级
指导教师刘玉强
学生姓名刘星
学号20030201037
2007年6月11日
心血宁颗粒质量标准研究
专题学生:
刘星指导教师:
刘玉强
【摘要】目的:
建立心血宁颗粒的质量标准。
方法:
采用TLC法对处方中的葛根进行鉴别;用高效液相法测定葛根素的含量。
结果:
在TLC色谱中均能检出葛根;含量测定方法精密度、稳定性良好,回收率为99.23,,9.23用高效液相法测定淫羊藿苷丹参;远志;颗粒中淫羊藿苷人参________________________________________________________________________________________________本品每袋含葛根素不得少于40.0mg。
结论:
所建立的方法对方中各组分可准确、快速地进行定性、定量检测。
【关键词】:
心血宁颗粒;鉴别;含量测定;高效液相;葛根;葛根素。
【Abstract】Objective:
ToestablishthequalitycontrolstandardofxinxueningGranules.methods:
radicespuerarirewereidentifiedbyTLC.ThecontentofHerbaepimediiisdeterminedbyHPLC.Results:
radicespuerarire,hawthornfruitcanbeidentifiedbyTLC.Thelimitcontentsofpuerarinis40.0mg。
Conclusions:
Themethodsaresimple,sensitive,accurateandwithagoodreproducibility.Themethodscanbeusedasaqualitycontrolstandardforthedrug.
【Keywords】:
xinxueninggranules;Identification;Determination;HPLC;Radixpuerariae;Puerarin。
前言
心血宁颗粒剂,用于心血瘀阻、瘀阻脑络引起的胸痹,眩晕,以及冠心病、高血压、心绞痛,高血脂症等症。
处方由葛根、山楂等组成。
方中葛根中主要含异黄酮类成分:
葛根素(puerarin),大豆甙元(daidzein),大豆甙(daidzein)、4’,7—二葡萄糖大豆甙元(daidzein—4’7—diglucoside)等黄酮类有效成分。
山楂主要含有黄酮、有机酸类成分。
本研究建立了心血宁颗粒的质量控制标准。
1.仪器与试剂、原料药材
1.1仪器ZF-2型三用紫外仪(上海市安亭电子仪器厂生产);
1.2材料:
薄层色谱装置(层析缸、玻璃板、定量用毛细管);硅胶G由青岛海洋化工集团生产,为薄层层析用;氯仿、甲醇为分析纯,水为蒸馏水;葛根素对照品由中国药品生物制品鉴定所提供,葛根素薄层板的铺制:
取硅胶G加0.2%羧甲基纤维素钠溶液按1:
2.5的比例,铺制成厚0.5mm,自然晾干后于105℃活化40分钟。
2、方法与结果
2.1定性鉴别
2.1.1葛根的薄层鉴别[1]:
2.1.1.1供试品溶液的制备:
取本品2g,研细,加甲醇10ml,超声提取10分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。
2.1.1.2对照药材溶液的制备:
取葛根素对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。
2.1.1.3阴性供试品溶液的制备:
取缺葛根的阴性供试品,同供试品溶液制备方法制备,作为阴性供试品溶液。
2.1.1.4鉴别:
依照薄层色谱法(2005年版《中国药典》一部附录VIB页)试验,吸取供试品溶液10μl,对照品溶液10μl,阴性供试品溶液10μl,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上,以氯仿-甲醇-水(7:
2.5:
0.25)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。
结果见附图1:
附图1、葛根的薄层鉴别
2.1.2山楂的薄层鉴别:
2.1.2.1供试品溶液的制备:
取本品约4g,研细,取粉末0.5g,置具塞锥形瓶中,加水10ml溶解后置分液漏斗用醋酸乙酯20ml提取,醋酸乙酯液水浴挥干,加甲醇1ml使溶解作为供试品溶液。
2.1.2.2对照品溶液的制备:
山楂对照药材加水煎煮20分钟,水提液放冷,用醋酸乙酯提取,醋酸乙酯液水浴挥干,加甲醇作为对照药材溶液。
2.1.2.3阴性供试品溶液的制备:
取缺山楂的阴性供试品,按供试品制备方法制备,作为阴性供试品溶液。
2.1.2.4鉴别:
。
取供试液和对照药材溶液点于同一硅胶G薄层板,以石油醚(60~90oC)-丙酮-甲酸(20:
20:
1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以三氯化铁试液,经多次试验,薄层色谱提示,供试液薄层斑点不清晰,阴性液有干扰。
后改用取供试液和对照药材溶液点于同一聚酰胺薄膜,以冰醋酸-水(25:
75)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以三氯化铝试液,100oC烘约5min,置紫外灯(365nm)下检视。
经多次试验,薄层色谱提示,供试液薄层斑点不清晰,阴性液有干扰。
见附图2。
(硅胶G薄层板) (聚酰胺薄膜)
附图2山楂的薄层鉴别
2.2.含量测定
2.2.1测定指标与测定方法的确立
本制剂由葛根、山楂二味中药经提取加工制成,拟以液相色谱法测定葛根中葛根素为定量指标,经试验葛根素与相邻组分分离度良好,且阴性液无干扰。
经方法学考察,方法的重复性、稳定性、精密度、回收率试验均符合有关规定,因此确立本制剂定量指标为葛根素,定量方法为液相色谱法。
2.2.2仪器与所用试剂
仪器:
江申LC-10型高效液相色谱仪,LC-10UV紫外检测器。
试剂:
甲醇为色谱纯,冰醋酸为分析纯。
蒸馏水为二次蒸馏水。
2.2.3测定波长的选择
经参考有关文献,并经绘制紫外图谱,确定测定波长为250nm。
紫外图谱测定条件为:
溶剂为60%乙醇,扫描纸速为40nm/cm,扫描区间400—200nm。
2.2.4色谱柱最低理论板数考察:
实验中我们采用不同色谱柱加以考察。
色谱条件为:
色谱柱:
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,柱温:
400C。
流动相为:
甲醇:
水:
醋酸(25:
75:
0.2)。
流速:
1.0ml/min。
检测波长:
250nm,测定时间:
30分钟。
柱1:
Shim-packVP-ODS(150L×4.6mm)SHIMADZU
柱2:
DiamonsilC185μm(150×4.6mm)迪马公司-色谱专家
柱3:
SpherigelC185μm(200×4.6mm)大连江申科学技术公司
2.2.4方法系统适用性试验考察
流动相的筛选与确立:
试验中曾选用甲醇:
水(25:
75)为流动相,测定结果提示,供试品中待测组分与相邻组分分离度不佳,后经多次筛选及参考文献报道,选用甲醇:
水:
冰醋酸(25:
75:
0.2)为流动相,经多次试验,供试品色谱中待测组分分离度良好。
在确立的色谱条件下,方法重复性良好。
2.2.5阴性干扰试验
取除去葛根以外的其它药材,按样品制备方法制成阴性液或无蔗糖阴性液。
精密吸取供试品溶液、阴性液、对照品溶液各5μl,注入液相色谱仪中,绘制液相色谱图,由色谱图提示,在对照品色谱相应的位置上,供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰,阴性液在此峰位无吸收,对本品中葛根素含量测定无干扰,方法专属性良好,见附图3、4、5。
附图3、供试品溶液高效液相色谱图
归一化法色谱定量报告
附图4、阴性液高效液相色谱图
附图5、对照品溶液高效液相色谱图
2.2.6对照品纯度检查
葛根素对照品,由中国药品生物制品检定所提供,批号(752-200108)为含量测定用。
经高效液相色谱法用归一化法测定,含量>98.5%,见附图6、7。
归一化法色谱定量报告
谱图文件:
对照品纯度检查
--------------------------------------------
保留时间峰面积含量标记
--------------------------------------------
分钟g/ml
--------------------------------------------
3.240228890.203
5.180456450.405
13.0751121310299.393
--------------------------------------------
合计11281636100.00
--------------------------------------------
附图6、对照品纯度检查对照品高效液相色谱图
归一化法色谱定量报告
谱图文件:
对照品纯度检查溶剂
--------------------------------------------
保留时间峰面积含量标记
--------------------------------------------
分钟g/ml
--------------------------------------------
1.337184069.595V
2.32711819661.615
4.5322433812.687V
5.1203089116.103
--------------------------------------------
合计191831100.00
--------------------------------------------
附图7、对照品纯度检查溶剂高效液相色谱图
2.2.7线性范围考察
精密称取葛根素对照品11.16mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取5ml,置100ml量瓶中,加甲稀释至刻度,摇匀,制成每1ml含葛根素0.0558mg的溶液。
分别精密吸取对照品溶液各2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μl溶液,注入液相色谱器仪中,测定色谱峰面积,测定结果见表1。
表1线性范围考察结果
对照品进样量μl
2.5
5.0
10.0
15.0
20.0
μg
0.1395
0.279
0.558
0.837
1.116
色谱峰面积
1372440
2930932
5815598
9016239
11784617
以进样量为横座标,色谱峰面积为纵座标,绘制标准曲线,经线性回归,回归方程为:
Y=10710682X-91423r=0.9995
由测定结果提示,葛根素进样量在0.1395~1.116μg范围内线性关系良好,见附图8。
Y=10710682X-91423r=0.9995
附图9、葛根素标准曲线
附图8标准曲线
2.2.8供试品溶液制备方法考察
鉴于葛根已经提取后加入,本试验拟以超声处理法制备供试液,试验中重点对提取溶剂、提取时间进行了考察,考察结果如下。
提取溶剂选择
根据葛根素的化学性质,本试验拟以30%乙醇、60%乙醇及乙醇为溶媒,对葛根素提取量加以考察,考察结果见表2。
表2提取溶剂考察结果
溶剂
含量(mg/g)
无蔗糖含量
(mg/g)
30%乙醇
38.72
38.65
60%乙醇
39.10
39.22
乙醇
37.96
37.46
测定结果表明,60%乙醇提取的葛根素含量较高,故确定选用60%乙醇为提取溶剂。
本试验选用超声处理法制备供试液对不同超声处理时间和超声处理条件进行了考察,考察结果见表3。
表3超声处理时间考察结果
提取时间(分)
样品含量(mg/g)
无蔗糖样品含量(mg/g)
10
35.12
35.23
20
39.33
39.42
30
39.34
39.45
考察结果表明,提取20分钟即可。
2.2.9稳定性试验考察
取本品4g,研细,取粉末0.10g,精密称定,按正文[含量测定]项下制备供试液,精密取同一供试液(批号040602),按0、2、4、6、8小时时间间隔,分别进样分析,测定色谱峰面积,测定结果见表3。
表3稳定性试验考察结果
放置时间(h)
0
2
4
6
8
RSD%
色谱峰面积
4126584
4002356
4112563
4184562
4201236
4125460
1.90
试验结果提示:
供试液制备后8小时内测定,色谱峰面积无明显变化,在此时间内,待测组分化学性质稳定。
2.3.0精密度试验考察
取本品4g(批号040602),研细,取粉末0.10g,精密称定,按正文[含量测定]项下方法制备供试液。
分别精密吸取5μl,连续进样5次,按前述色谱条件进样分析,测定色谱峰面积,测定结果见表4。
表4精密度试验测定结果
序号
1
2
3
4
5
RSD%
色谱峰面积
4181007
4149681
4119127
4257427
4171735
4175795
1.23
测定结果表明,本试验精密度试验符合有关规定。
2.3.1重复性试验考察
取五份(批号040602)样品4g,研细,取0.10g,精密称定,分别按样品[含量测定]项下方法操作,测定,测定结果见表5。
表5重复性试验测定结果
序号
1
2
3
4
5
RSD%
样品中含量(mg/g)
38.31
38.32
37.55
37.34
37.12
37.73
1.48
测定结果表明,本方法重复性试验符合有关规定。
2.3.2回收率试验考察
取本品(批号040602,含量37.73mg/g),研细,取粉末0.10g,精密称定,精密加入葛根素对照品甲醇溶液(1.226mg/ml)3ml,按样品含量测定项下方法操作,测定,测定结果见表6。
表6回收率试验测定结果
序号
取样量g
样品含量(mg)
对照品加入量(mg)
实测总量(mg)
回收率%
%
RSD%
1
0.1012
3.818
3.678
7.553
101.5
2
0.1099
4.147
3.678
7.788
99.0
3
0.1078
4.067
3.678
7.739
99.8
99.23
1.40
4
0.0992
3.743
3.678
7.332
97.6
5
0.0971
3.664
3.678
7.276
98.2
测定结果提示:
本方法对于本品回收率在97.6~101.5%之间,RSD为1.40%,符合有关规定。
2.3.3样品含量测定数据
经采用正文[含量测定]项下方法,测定十批样品中葛根素含量,测定结果见表7。
表710批样品含量测定结果
批号
样品含量(mg/袋)
1
2
040601
50.23
50.25
50.24
040602
75.45
75.47
75.46
040603
66.34
66.36
66.35
040801
49.32
49.30
49.31
040802
69.73
69.74
69.74
040803
67.34
67.34
67.34
040901
75.02
75.01
75.02
040902
70.12
70.11
70.12
040903
68.89
68.89
68.89
040904
56.14
56.15
56.15
根据上述测定结果,暂定本品每袋含葛根以葛根素计算,不得少于40mg。
在流动相的选择上,曾试过以甲醇-水[2~4]不同比例为流动相的方法,但分离效果都不甚理想,后来改成甲醇-水(25∶75)后,样品中葛根素峰与相邻峰达到良好分离。
在此条件下,葛根素与相邻色谱峰分离度良好,峰形对称,阴性对照无干扰,故收入标准。
参考文献:
[1] 中国药典2000年版一部[S].2000:
607-608.
[2] 中华人民共和国卫生部.部颁标准(第四册)[S].北京:
化学工业出版社,2000:
169.
[3] 唐丽琴,刘 圣,陈礼明,等.高效液相色谱法测定复方黄连颗粒中葛根素的含量[J].中国药房,2003,14(7):
425-427.
[4] 韩晓燕,彭 勋,温 敏,等.高效液相色谱法测定双降胶囊中葛根素的含量[J].中国药事,2002,16(11):
695-696.
致谢
首先感谢学校给予我这次难忘的实习机会,使我将所学的理论知识能与实际相结合,并且掌握了多种实验技能;在专题过程中指导老师刘玉强老师给予我许多指导和建议,帮助我顺利完成实验,在此表示最亲切的感谢和敬意。
同是,也要感谢药剂教研室其他老师给予本人的宝贵意见和真诚帮助,如程岚老师,吕佳老师、赵琳老师,袁子民老师!
以及药剂教研室的实习同学对我的帮助。
在这里我对大家表示最衷心的谢意!
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