胡黄连苷II对肝细胞凋亡的抑制作用1.docx
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胡黄连苷II对肝细胞凋亡的抑制作用1
胡黄连苷II对肝细胞凋亡的抑制作用
摘要
目的:
探讨胡黄连苷II对肝细胞凋亡的影响和其机制。
方法:
形态学变化和细胞凋亡的定量通过透射电子显微镜和流式细胞仪分别测定。
DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳被可视化。
半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),用于分析B细胞淋巴瘤(bcl-2)和苯海拉明(Bax)基因的表达。
肝线粒体中的超氧化物歧化酶(SOD)的含量通过马兰方法检测。
丙二醛(MDA)成份和肝组织中的蛋白质水平用硫代巴比妥酸比色法和酚法(Lowry)确定。
结果:
胡黄连苷II降低由D-半乳糖胺(DGalN)和脂多糖(LPS)引起的急性肝损伤小鼠血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平,它也减少丙二醛(MDA)的含量,并且因此,提高了超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
胡黄连苷II10毫克/千克,以剂量依赖的方式保护肝细胞免受细胞凋亡,上调b淋巴细胞瘤-2(bcl-2)基因的表达,从而增加了bcl-2/bax比值。
结论:
胡黄连苷II可以保护肝细胞免受伤害,防止肝细胞凋亡。
它可能通过上调bcl-2基因的表达和抗氧化作用。
1.介绍
胡黄连属植物家族,玄参。
胡黄连干茎用于医学。
许多发表的研究报告发现它可以保护多种肝细胞的损伤,但其作用机制尚未阐明。
胡黄连苷II是从胡黄连提取的最有效的成分之一。
为了探讨其作用机制,胡黄连苷II对肝细胞的保护作用,已经建立了体内和体外的肝细胞凋亡模型。
透射电子显微镜,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪被用来评估对肝细胞凋亡的影响。
半定量RT-PCR与图像一起处理被用来分析BCL-2和baxmRNA其与细胞凋亡是高度相关的,免疫组化用于观察Bcl-2和Bax蛋白表达。
连同其他几个氧化指标,我们试图证明胡黄连苷II对保护肝脏细胞凋亡的作用机制。
2.材料和方法
2.1动物
72个昆明种小鼠(20±2克)和2个SD大鼠(70±10克),由动物军事医学科学院供给(北京学术中心中国),雌雄的数量相同的。
2.2.材料
胡黄连苷II是由Bescholor供给北京大学中国(北京)研究中心。
联苯双酯(DDB)分别从北京联合制药厂获得(中国北京)。
D-半乳糖胺(D-氨基半乳糖),脂多糖(LPS),放线菌素D(act-D),以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分别购自Sigma公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。
核糖核酸酶A,牛胎儿血清(FBS),焦碳酸二乙酯(DEPC),Trizol试剂均购自Gibco/BRL公司(加利福尼亚州,美国)。
Bcl-2的单克隆抗体和Bax蛋白多克隆抗体购自SantaCruz公司(加利福尼亚州,美国)。
逆转录试剂从Promega公司化工有限公司(美国,麦迪逊,Wisconscin)获得。
谷丙转氨酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂,丙二醛(MDA),锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD),链霉亲和素过氧化物酶(SP)都是国内产品。
3.模型建立和治疗
3.1.体内
在实验开始之前,72只小鼠随机分为6个组。
五组用D-半乳糖胺(700毫克/千克,iP)和脂多糖(LPS)(1微克/千克,iP)治疗,在体内建立肝细胞凋亡模型,其中的4个组D-氨基半乳糖和脂多糖(LPS)管理4小时后分别被注入胡黄连苷II:
5毫克/千克,10毫克/千克,20毫克/千克,或溶液(0.9%NaCl)10分钟前。
一组接收到的联苯双酯(DDB)(200
毫克/千克)与相同的操作作为阳性对照。
剩余的组作为阴性对照。
成立模型五小时后,各组6个小鼠的血取样从眼圈静脉。
ALT(谷丙转氨酶)和AST(谷草转氨酶)血清中被监测(连续使用全国临床推荐的监测方法,化学联盟)。
各组小鼠剩余的6个肝组织剪切部分(左侧部分)准备病理评估和Bcl-2/Bax蛋白的免疫组化检测。
肝悬浮液(20%)从肝脏其余的部分制作和储存在-20℃下,为了检测肝细胞线粒体超氧化物歧化酶(SOD)(马兰方法),蛋白水平(用Lowry法)和肝组织丙二醛(MDA)的含量(TBA比色法)。
另1毫升肝悬浮液于12000转下离心分离20分钟。
400μL上层液体,1毫升乙醇和50μL(5摩尔/L)被混合在一起,并储存在-20℃下为DNA片段化分析。
如前面描述的[1]原代培养大鼠肝细胞分离。
大鼠麻醉下断头。
在原位灌注即钙和镁-自由的Hanks'盐溶液随着含有胶原酶的介质通过大鼠肝门静脉灌注,该悬浮液含有大鼠肝细胞被收集。
然后将悬浮液以120×g,4℃下离心5分钟。
细胞用冷Hanks液沉淀洗涤两次,并将细胞浓度调制到1×109/L将细胞接种在24孔组成的dmem(必需培养基)生长培养基中的培养板上带有20%FBS(胎牛血清),37℃在5%CO2的水饱和气氛中。
24小时后,培养基被丢弃,并细胞暴露于一系列胡黄连苷II的浓度(0.005,0.01,和0.02毫摩尔/升)。
1小时后,ACT-D50微克/升被补充,30分钟后TNF-α的3000KU/L,另一个24小时连续加入。
阴性对照组设置被暴露在正常培养基中。
肝细胞凋亡的评估和细胞凋亡相关基因bcl-2和bax的mRNA提取然后执行。
马兰方法用于检测肝线粒体超氧化物歧化酶(SOD)的含量。
肝组织的丙二醛(MDA)含量用TBA比色法检测和肝脏的蛋白质含量用Lowry法进行了分析。
血清中ALT和AST
通过连续监测法进行检测(建议由国际临床化学联盟)。
3.2.免疫组化分析
肝组织固定在4%多聚甲醛里24小时,并以常规法包埋在石蜡里,继续为5μm的切片。
该SP方法假设。
Bcl-2的单克隆抗体(1:
50)或Bax多克隆抗体(1:
50)作为主抗体应用,并在4℃孵育过夜或在室温下60分钟。
切片观察并通过光学显微镜拍摄,bcl-2和Bax阳性染色面积百分比被半定量分析使用CMIAS-008图片分析仪(北京,中国)。
3.3.逆转录-聚合酶链反应检测
各组总的细胞质RNA从由TRIZOL方法1.5×107培养细胞分离出(根据GIBCO规范)。
RNA的浓度被检测通过在260nm处的吸光度,和其完整性是在1%琼脂糖凝胶上通过电泳证实,然后用0.1mg/L的溴化乙锭(EB)染色。
总的RNA1微克被转化互补DNA(cDNA)用15U逆转录酶在20μL缓冲液,含有1毫摩尔/L的脱氧-NTP,1URNase抑制剂,和0.5μg寡聚(脱氧胸苷)15引物。
等分试样(5%)的cDNA的扩增使用反向(5'-AGAGGGGCT
ACGAGTGGGAT-3')和正向引物(5'-CTCAGTCATCCACAGGGCGA-3'),得到450bp的聚合酶链反应(PCR)bcl-2的产品,反向(5'-GGTTTCCGAGACATCCAGGATGG-3')和正向引物(5'-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3'),得到429bp的PCRBax产品。
为了验证相等量的cDNA在PCR反应中存在,β-肌动蛋白被分别用Bcl-2和Bax基因扩增,
反向(5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3')和正向引物(5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3'),得到240bpPCR产物。
PCR条件如下:
在94℃预变性5分钟,在94ºC变性30秒,退火温度为60ºC(bcl-2和β-肌动蛋白)或64ºC(BAX)40秒,72℃用TaqDNA聚合酶聚合40s。
28个循环后,20μLbcl-2或BaxPCR产物和用相同的模板的β-肌动蛋白的PCR在一起的产物用电泳分离和EB染色显示。
然后,电泳凝胶每个频带用Imagemaster和软件图像分析仪进行半定量分析(北京,中国)。
bcl-2和baxmRNA表达靶基因信号强度水平的比值与共扩增的β-肌动蛋白有关。
3.4.流式细胞仪分析
培养肝细胞各组为1×109/L被收获,均在4℃下,用PBS洗涤,并暴露到预冷的乙醇4℃下30分钟。
他们再次用PBS洗涤,暴露到PI50mg/L,0.1%洗涤表面活性剂TritonX-100,0.01毫摩尔/L的EDTA(Na)2和RNase50mg/L在黑暗正常温度下12-24小时。
标本然后提交给FACS-420型流式细胞仪分析仪(纽约,BectonDickinson公司和公司,美国)评估细胞凋亡水平。
3.5.DNA片段化分析
各组培养肝细胞在Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)20mmol/L(pH8.0)溶解,10mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA),和0.5%月桂基十二烷基肌氨酸钠含有200mg/L的蛋白酶K。
DNA通过超离心萃取,用乙醇沉淀,并用核糖核酸酶治疗。
然后将DNA加载到1%-2%的琼脂糖凝胶含有溴化乙锭(EB),在UV透照下拍摄和观察
3.6.形态学评价光学显微镜分析
从各组小鼠的肝组织切片被制备并用hematoxyline-曙红(HE)染色,然后在200倍或400倍的光学显微镜下观察。
3.7.透射电子显微镜测定
肝组织标本被固定和分别用戊二醛和氧化锇后缀,用丙酮脱水,嵌入eposy树脂。
超薄切片被收集和柠檬酸铅复染和用JEM100CX透射型电子显微镜查看(日本,东京)。
3.8.统计分析
所有结果表示为平均值±标准差。
采用t检验对数据进行了评估,P<0.05
被认为是stastically意义。
4.结果
4.1.胡黄连苷II对小鼠遭受D-氨基半乳糖和LPS诱导的急性肝损的血清中ALT和AST的影响
模型组中的ALT和AST值均显着高于阴性对照组(P<0.01)。
胡黄连苷II在以剂量依赖的方式降低ALT和AST值(P<0.05或P<0.01,与模型对照组)。
用DDB200毫克/公斤治疗的阳性对照组ALT和AST值下降,尤其是ALT。
结果显示胡黄连苷II可以保护肝组织免受D-半乳糖胺和LPS诱导的急性损伤,这是更强大的比DDB(表1)。
4.2..胡黄连苷II对小鼠遭受D-氨基半乳糖和LPS诱导的急性肝损伤MDA和SOD含量的影响
模型组的SOD值下降,但MDA与阴性对照组相比值升高(P<0.01)。
所有暴露在胡黄连苷II组中的MDA含量显著下降,而SOD与模型组相比增加。
这种效应显示剂量依赖的方式(P<0.05或P<0.01)(表2)。
4.3.Bcl-2和Bax蛋白表达的免疫组化分析
有几个阴性对照组的肝细胞细胞质中检测到浅黄色颗粒(Bcl-2蛋白)。
模型组中有更多的颗粒和大部分被发现在胡黄连苷II的治疗组(图1A)。
小BUFF颗粒(Bax蛋白)在正常肝细胞中被检测。
模型组颗粒的量更多,并分散存在或颜色集中更重比其他组。
用胡黄连苷II处理组Bax蛋白表达降低(图1B)。
胡黄连苷II治疗组和阴性对照组之间有显著地的差异(P<0.05或P<0.01)。
胡黄连苷II组和模型对照组之间的差异也是显著地(P<0.05或P<0.01,表3)。
这些结果表明,胡黄连苷II可以有效地上调凋亡相关基因bcl-2的表达和抑制Bax表达。
增加bcl-2/bax的比,从而抵消了肝细胞凋亡。
4.4.细胞凋亡相关基因Bax和bcl-2基因半定量RT-PCR分析
每个组提取总RNA,被装上1%琼脂糖凝胶,28秒,18秒,和5秒波段可以清楚地观察到,证实总RNA的完整性(图2)。
另外,在本研究中,20μL的BCL-2或baxPCR产物与相同的模板β-肌动蛋白PCR产物一起电泳分离和EB染色显示。
BCL-2,胡黄连苷II20g/L的处理组Bax和β-肌动蛋白的PCR产品是450个基点,429个基点,240基点(图3),最少在阴性对照组;baxmRNA大部分在模型组里,其次阴性组,和最少在胡黄连苷II的治疗组。
4.5.通过光学显微镜检测的形态学评价
通过D-氨基半乳糖和LPS诱导的肝细胞显示嗜酸性特征,并在细胞质有嗜酸性机构。
胡黄连苷II10和20g/L的治疗组没有明显的病理变化(图4)。
4.6.透射电子显微镜测定
正常肝细胞包膜完整,细胞质扩散,核膜明显,承担核大。
在初始阶段的细胞对凝聚的或边缘染色质凋亡收缩并压实。
染色质逐渐剥落成碎片或半月形状态和细胞质变冷凝。
此外,质膜皱缩,形成凋亡小体,细胞凋亡的一大部分标记被观察到(图5)。
4.7.DNA片段化分析
图6示出了该模型组(泳道2和7)表现出DNA梯状条带特性。
胡黄连苷II5,10,20g/L的治疗组(分别泳道6,5和4),DNA梯状特点很少。
胡黄连苷II20g/L的处理组
(泳道4)与阴性组(泳道3)是类似的。
4.8.流式细胞仪检测细胞凋亡
阴性对组的原代肝细胞的细胞凋亡率为4.1%,模型组为22.3%,与胡黄连苷II20,10,5g/L的分别为6.9%,10.7%和15.1%,这表明胡黄连苷II可以保护肝细胞抗凋亡,并以剂量依赖的方式采取行动(图7)。
5.讨论
病毒性肝炎的发病机制与肝细胞坏死和凋亡密切相关。
肝炎病毒入侵肝脏或肝细胞癌变会导致肝细胞凋亡[9-11]。
在炎症肝炎,嗜酸性体(萎缩坏死,凋亡细胞)和零碎坏死是肝细胞的凋亡形态学表现特点。
受病毒感染的肝细胞能形成主要防止病毒的复制和从受感染的细胞中扩散[12]的保护机制。
凋亡的细胞死亡有助于去除感染或癌变细胞,但过度凋亡会导致暴发性肝炎[13,14]。
一般情况下,药物是用来阻止肝细胞凋亡,目的是治疗重型肝炎,并诱导肝细胞凋亡为消除感染和癌变细胞。
其中细胞凋亡的一个重要的分子机制可能是bcl-2基因族的表达调制,其对细胞凋亡共同通路起着关键作用。
以往的研究表明Bcl-2族的蛋白可以抑制慢性感染肝细胞,骨髓间质干细胞和神经细胞的细胞凋亡。
生物Bcl-2蛋白的生理功能是增加抵抗许多凋亡因子的能力,抵消细胞凋亡的效果,并延长寿命。
Bax,另一个重要的凋亡调制基因产物,与Bcl-2高度相关。
Bax通过与Bcl-2结合使Bcl-2基因失活,以形成一个异构二聚体。
mRNA和Bcl-2与Bax的蛋白比例是一个关键因素在确定细胞接触到许多伤害时,凋亡是否可以发生[21]。
研究表明,TNF-α可诱导肝细胞凋亡,从而参与肝脏疾病的发病。
然而,TNF-α自身的剂量不会在体内和体外起作用,除非它与放线菌素d和D-半乳糖胺一起使用。
放线菌素d是RNA转录的抑制剂,并可以使细胞对TNF-α的毒性敏感[23]。
因此,放线菌素d和TNF-α被经常用来建立体内以及体外肝细胞凋亡模型[24]。
本研究假设放线菌素d与肿瘤坏死因子-α一起建立实验凋亡模型,DNA的琼脂糖凝胶电泳,和流式细胞仪检测,被用来评估肝细胞凋亡;光透射电子显微镜用于观察的细胞和组织的形态学变化;和定量分析的大鼠肝细胞凋亡。
这些结果表明,胡黄连苷II明显的抑制肝细胞的形态变化,DNA断裂,和亚G1尖峰的增加(细胞凋亡代表比例)。
免疫组化和半定量RT-PCR分析Bcl-2,Bax表达和bcl-2和Bax基因的mRNA表明,bcl-2蛋白和Bax蛋白在肝细胞损伤后增加,尤其是Bax。
肝细胞损伤后Bax蛋白表达。
Bcl-2的水平,Bcl-2/Bax比值在胡黄连苷II处理组显著增加和细胞凋亡的变化也被抑制。
MDA是脂质过氧化,其成份通常反映了脂质过氧化水平,间接反映体内损伤的程度。
SOD是一个关键的因素影响氧化和抗氧化作用的平衡,其活性能间接反映了消除氧自由基激进的能力。
生物膜对于进行脂质过氧化损伤是主要的地方。
炎性细胞的活性氧可诱导细胞凋亡当脂质过氧化损伤出现在线粒体和微粒体膜时。
通过基因转录的细胞表型的变化可成为
通过氧化损伤导致的细胞凋亡的机制之一。
目前的研究还表明,胡黄连苷II能同时降低丙二醛(MDA),ALT,AST的水平,并增加肝线粒体超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
总之,我们第一次表明胡黄连苷II能保护肝细胞免受伤害,和通过它的抗氧化作用抵消凋亡,并且它可以通过降低MDA水平,增加肝线粒体超氧化物歧化酶(SOD)活性和上调bcl-2基因表达。
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