中国药科大学药物代谢动力学实验考查知识点整理.docx
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中国药科大学药物代谢动力学实验考查知识点整理
中国药科大学药物代谢动力学实验考查知识点整理
药物代谢动力学实验考查知识点整理
第一部分:
HPLC使用注意事项
1、HPLC组成:
泵、进样器、色谱柱、检测器、数据系统/积分仪
2、反相色谱:
分离机理:
“反相色谱”固定相极性小于流动相极性常用流动相:
乙腈、甲醇,水3、色谱柱的分类:
按填料:
球形、无定形按含碳量:
C18、C8
按应用:
分析柱、制备柱、预处理柱按粒径:
150mm*,5μm等按填料类型:
正相柱、反相柱、手性柱4、键合相色谱柱的优缺点:
优点:
稳定不易流失;
应用广泛,可使用多种溶剂;消除硅羟基的不良影响;
缺点:
pH得在3~8范围内
5、C18柱的活化:
90%10%90%的甲醇溶液1ml/min依次冲洗30min6、流动相:
使用之前需超声脱气 目的:
色谱泵输液准确 提高检测性能
保护色谱柱
流动相脱气的方法:
加热,抽真空,超声,通惰性气体 流动相组成:
流动相配置:
缓冲溶液现用现配,不要储存时间过长,避免pH值发生变
化和成分分解,影响色谱分离的效果;
有机溶液和缓冲液使用前均需经μm微孔滤膜过滤; 流动相使用前脱气。
7、常用定量方法:
外标法
内标法 内标物的要求:
化学结构与待测品相似;样品中不存在;
不与样品组分发生化学反应;保留值与待测值接近;浓度相当;与其他色谱峰分离好
8、样品的预处理:
目的:
除杂质;浓缩微量成分;改善分离;保护色谱柱;提
高检测灵敏度
方法:
高速离心,过滤,选择性沉淀,衍生反应;液固萃取、
液液萃取
沉淀蛋白的溶剂:
有机溶剂:
乙腈、甲醇 强酸:
三氯乙酸、过氯酸 盐:
50%硫酸铵、10%TCA分析测定用试剂为色谱纯及以上,水为超纯水第二部分:
实验设计
1、考虑问题:
动物种属、给药剂量、取血时间、采样量、血药浓度
大概范围
2、分析方法建立:
色谱柱、流动相组成、柱温箱温度、样品处理方
法、风量下限与标曲范围
第三部分:
实验相关条件与数据处理 实验一:
1、采血点设计一般原则
为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线,采样时间点的
设计应兼顾药物的吸收相、平衡相和消除相。
一般在吸收相至少需要2~3个采样点,对于吸收快的血管外给药的药物,应尽量避免第一个点是峰浓度;在Cmax附近至少需要3个采样点;消除相需要4~6个采样点。
整个采样时间至少应持续到3~5个半衰期,或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。
为保证最佳采样点,建议在正式试验前,选择2~3只动物进行
预试验,然后根据预试验的结果,审核并修正原设计的采样点。
2、动物给药方式:
股静脉注射3、麻醉:
腹腔注射20%乌拉坦
4、采血方式:
眼眶静脉丛采血
5、蛋白沉淀方式:
10%高氯酸,涡旋,15000rpm10min,取100ul上
清二次离心
6、非那西丁色谱条件
流动相:
50mM磷酸盐缓冲液中,并稀释到1L):
乙腈
色谱柱:
岛津ShimadzuVP-ODS;150×;5μm 检测波长:
254nm 柱温:
40℃ 进样体积:
20μL
6、参数计算
曲线线性判断为一房室模型,参数计算如下:
参数C0T1/2kVdCLMRTAUC公式y=令x=0得y=令y=得T1/2=/k得Vd=X(给药量)/C0X=*2mg/ml=CL=k*VdMRT=1/kAUC=X/CL值μl/ml 480μ
参数kAUC非房室值μ-k/=-AUC0~100min=AUC100~∞=C100min/k=AUC0~100min+AUC100~∞=+AUMC0~100min=9030 AUMC100~∞=t100minC100min/k+C100min/k2=AUMC=AUMC0~100min+AUMC100~∞MRT=AUMC/AUCMRT=1/kC0=Div/VSS=/Div/AUC=/μAUMCMRTC0T1/2CLVss12171μg*min2/ml/40minμl/ml无VSS=/AUC2=*/
实验二:
1、肝微粒体的制备方法版本一:
获取肝脏:
大鼠禁食不禁水24小时后取肝脏,组织匀浆:
称重剪成碎块后加入匀浆液制成匀浆。
差速离心:
匀浆液4℃9000g离心15min,弃去沉淀和脂肪层取上清
液于100000g离心管中离心20min,弃上清,沉淀用pbs轻轻冲洗。
重悬沉淀:
用10ml匀浆液重悬,冻存管分装后置-80℃冰箱内保存蛋白定量:
BCA法版本二:
大鼠拉颈椎处死,开腹取肝脏,用滤纸吸干水分,称质量。
立即
放入冰冷的蔗糖溶液中清洗,用剪刀剪成碎块,反复清洗至无血色。
加4倍肝质量的蔗糖溶液,在冰浴中用组织匀浆机制成匀浆,再超声分散30s,4C下10000r/min-离心20min。
上清液用四层纱布过滤除漂浮脂物,滤液在4C下50000r/min离心60min,弃上清液,沉淀用焦磷酸钾缓冲液悬浮均匀,在4C下50000r/min离心60min,沉淀即为肝微粒体。
用TrisHCl缓冲液悬浮均匀,体积为原上清液的1/4即可,分装于塑料管中,于-80C保存,采用Lowry法测定肝微粒体蛋白浓度版本三:
2、NADPH体系:
葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-P-OH)β-NADP+氯化镁5Mm
3、温孵实验步骤:
肝微粒体,非那西丁溶液,37℃水浴预温孵5min,
加入NADPH体系溶液,37℃水浴温孵,30min,加入冰甲醇,终止温孵,
涡旋1min,高速离心10min,转移上清液200μl4、数据处理
双倒数法1/V的截距为1/Vmax,1/[S]的截距为-1/Km
药物代谢动力学实验考查知识点整理
第一部分:
HPLC使用注意事项
1、HPLC组成:
泵、进样器、色谱柱、检测器、数据系统/积分仪
2、反相色谱:
分离机理:
“反相色谱”固定相极性小于流动相极性常用流动相:
乙腈、甲醇,水3、色谱柱的分类:
按填料:
球形、无定形按含碳量:
C18、C8
按应用:
分析柱、制备柱、预处理柱按粒径:
150mm*,5μm等按填料类型:
正相柱、反相柱、手性柱4、键合相色谱柱的优缺点:
优点:
稳定不易流失;
应用广泛,可使用多种溶剂;消除硅羟基的不良影响;
缺点:
pH得在3~8范围内
5、C18柱的活化:
90%10%90%的甲醇溶液1ml/min依次冲洗30min6、流动相:
使用之前需超声脱气 目的:
色谱泵输液准确 提高检测性能
保护色谱柱
流动相脱气的方法:
加热,抽真空,超声,通惰性气体 流动相组成:
流动相配置:
缓冲溶液现用现配,不要储存时间过长,避免pH值发生变
化和成分分解,影响色谱分离的效果;
有机溶液和缓冲液使用前均需经μm微孔滤膜过滤; 流动相使用前脱气。
7、常用定量方法:
外标法
内标法 内标物的要求:
化学结构与待测品相似;样品中不存在;
不与样品组分发生化学反应;保留值与待测值接近;浓度相当;与其他色谱峰分离好
8、样品的预处理:
目的:
除杂质;浓缩微量成分;改善分离;保护色谱柱;提
高检测灵敏度
方法:
高速离心,过滤,选择性沉淀,衍生反应;液固萃取、
液液萃取
沉淀蛋白的溶剂:
有机溶剂:
乙腈、甲醇 强酸:
三氯乙酸、过氯酸 盐:
50%硫酸铵、10%TCA分析测定用试剂为色谱纯及以上,水为超纯水第二部分:
实验设计
1、考虑问题:
动物种属、给药剂量、取血时间、采样量、血药浓度
大概范围
2、分析方法建立:
色谱柱、流动相组成、柱温箱温度、样品处理方
法、风量下限与标曲范围
第三部分:
实验相关条件与数据处理 实验一:
1、采血点设计一般原则
为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线,采样时间点的
设计应兼顾药物的吸收相、平衡相和消除相。
一般在吸收相至少需要2~3个采样点,对于吸收快的血管外给药的药物,应尽量避免第一个点是峰浓度;在Cmax附近至少需要3个采样点;消除相需要4~6个采样点。
整个采样时间至少应持续到3~5个半衰期,或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。
为保证最佳采样点,建议在正式试验前,选择2~3只动物进行
预试验,然后根据预试验的结果,审核并修正原设计的采样点。
2、动物给药方式:
股静脉注射3、麻醉:
腹腔注射20%乌拉坦
4、采血方式:
眼眶静脉丛采血
5、蛋白沉淀方式:
10%高氯酸,涡旋,15000rpm10min,取100ul上
清二次离心
6、非那西丁色谱条件
流动相:
50mM磷酸盐缓冲液中,并稀释到1L):
乙腈
色谱柱:
岛津ShimadzuVP-ODS;150×;5μm 检测波长:
254nm 柱温:
40℃ 进样体积:
20μL
6、参数计算
曲线线性判断为一房室模型,参数计算如下:
参数C0T1/2kVdCLMRTAUC公式y=令x=0得y=令y=得T1/2=/k得Vd=X(给药量)/C0X=*2mg/ml=CL=k*VdMRT=1/kAUC=X/CL值μl/ml 480μ
参数kAUC非房室值μ-k/=-AUC0~100min=AUC100~∞=C100min/k=AUC0~100min+AUC100~∞=+AUMC0~100min=9030 AUMC100~∞=t100minC100min/k+C100min/k2=AUMC=AUMC0~100min+AUMC100~∞MRT=AUMC/AUCMRT=1/kC0=Div/VSS=/Div/AUC=/μAUMCMRTC0T1/2CLVss12171μg*min2/ml/40minμl/ml无VSS=/AUC2=*/
实验二:
1、肝微粒体的制备方法版本一:
获取肝脏:
大鼠禁食不禁水24小时后取肝脏,组织匀浆:
称重剪成碎块后加入匀浆液制成匀浆。
差速离心:
匀浆液4℃9000g离心15min,弃去沉淀和脂肪层取上清
液于100000g离心管中离心20min,弃上清,沉淀用pbs轻轻冲洗。
重悬沉淀:
用10ml匀浆液重悬,冻存管分装后置-80℃冰箱内保存蛋白定量:
BCA法版本二:
大鼠拉颈椎处死,开腹取肝脏,用滤纸吸干水分,称质量。
立即
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