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蹄角蛋白降解菌的选育及其酶活性质的研究
硕士学位论文
蹄角蛋白降解菌的选育及其酶活性质的研究
研究生:
程宇
导师:
任大明教授
专业:
生物化学与分子生物学
研究方向:
微生物生物化学与分子生物学
沈阳农业大学
二○○九年五月
DissertationforMaster’sDegree
Thefiltratingofthekeratindegradingbacteriaandtheresearchforthepropertyoftheenzyme
Candidate:
ChengYu
Supervisor:
Renda-ming
Speciality:
Biochemistryandmolecularbiology
ResearchField:
Microorganism,biochemistryandmolecularbiology
ShenyangAgriculturalUniversity
May,2009
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名:
时间:
年月日
导师签名:
时间:
年月日
关于论文使用授权的说明
本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:
学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名:
时间:
年月日
导师签名:
时间:
年月日
目录
摘要1
Abstract2
第一章前言3
1.1角蛋白简介3
1.2可降解角蛋白的微生物4
1.3利用生物技术手段降解角蛋白的生化机制5
1.3.1角蛋白降解生化机制理论5
1.3.2角蛋白的酶解机理6
1.4降解角蛋白的加工方法7
1.4.1角蛋白水解原理7
1.4.2角蛋白水解方法8
1.5角蛋白降解物的应用9
1.5.1饲料添加剂9
1.5.2肥料10
1.5.3农药和医药10
1.5.4其它用途10
第二章降解动物蹄角蛋白的菌种选育和鉴定12
2.1材料与方法12
2.1.1材料12
2.1.2培养基13
2.1.3方法13
2.2结果与讨论16
2.2.1角蛋白分解菌的富集、分离与筛选16
2.2.2菌种鉴定18
2.3小节21
第三章发酵条件的优化22
3.1材料与方法22
3.1.1材料22
3.1.2培养基22
3.1.3发酵条件优化23
3.1.4角蛋白分解菌对不同底物的活性23
3.2结果与讨论24
3.2.1发酵条件优化结果24
3.2.2角蛋白分解菌对不同底物的降解27
3.3小节27
第四章粗酶液理化性质研究28
4.1.材料和方法28
4.1.1材料28
4.1.2培养基28
4.1.3发酵培养方法29
4.1.4角蛋白酶活性的测定方法确定29
4.1.5抗生素的选择以及量的比较29
4.1.6粗酶液理化性质研究30
4.2结果与分析31
4.2.1抗生素的选择及比较31
4.2.2粗酶液理化性质研究32
4.3小节36
结论与展望37
参考文献38
致谢42
攻读硕士学位期间发表的学术论文43
Contents
ChineseAbstract……………………………………………………………………………………1
EnglishAbstract……………………………………………………………………………………2
ChapterIPreface……………………………………………………………………………………3
1.1Summaryofkeratin3
1.2Microorganismswhichcandecomposekeratin4
1.3Thebiochemistryprincipleforhydrolyzingkeratinusingthebiotechnologicalmethod5
1.3.1Biochemicalmechanismofdecomposingkeratin5
1.3.2Theprincipleforhydrolyzingkeratin6
1.4Processingmethodsofdecomposingkeratin7
1.4.1Theprincipleforhydrolyzingkeratin7
1.4.2Themethodforhydrolyzingkeratin8
1.5Applicationsofdegradationproducts9
1.5.1Feedadditive9
1.5.2Fertilizer10
1.5.3Pesticideandmedicine10
1.5.4Otherapplications10
ChapterIIisolationandcharacterizationofastrainofnewanimalhoofkeratin-degradingBacteria
12
2.1MaterialsandMethods12
2.1.1Materials12
2.1.2Culturemedium13
2.1.3Methods13
2.2Resultsandanalysis16
2.2.1Theenrichment,separationandfiltrateofthekeratindecomposingbacteria16
2.2.2Identificationofstrain18
2.3Briefsummary21
ChapterIIIoptimizationoffermentationcondition22
3.1MaterialsandMethods22
3.1.1Materials22
3.1.2Culturemedium22
3.1.3Optimizationoffermentationcondition23
3.1.4Theactivityofthekeratinbacteriatodifferentsubstance23
3.2Resultsandanalysis24
3.2.1Resultofoptimizationoffermentationcondition24
3.2.2Thedecomposingexperimentofthekeratinbacteriatodifferentsubstance27
3.3Briefsummary27
ChapterIVtheresearchofthephysicalandchemicalcharacteroftherareenzyme28
4.1MaterialsandMethods28
4.1.1Materials28
4.1.2Culturemedium28
4.1.3Culturemethodforferment29
4.1.4Themeasuringmethodfortherareenzymeactivity29
4.1.5Thechoiceanddosecomparisionoftheantibiotic29
4.1.6Theresearchofthephysicalandchemicalcharacteroftherareenzyme30
4.2Resultsandanalysis31
4.2.1Thechoiceandcomparisionoftheantibiotic31
4.2.2Thephysicalandchemicalcharacteroftherareenzyme32
4.3Briefsummary36
Conclusionandexpectation………………………………………………………………………37
References……………………………………………………………………………………………38
Acknowledgement…………………………………………………………………………………42
Publicationduringthepostgraduate……………………………………………………43
摘要
通过比较从特定土壤中分离得到的菌株对动物蹄角蛋白质的降解率,筛选到一株能够有效分解动物蹄角蛋白质的菌株;该菌株在30℃条件下培养3days,对蹄角蛋白的降解率可以达到45.35%。
通过形态学观察、生理生化特征及16SrDNA序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),并将其命名为BacillussubtilisA2。
该枯草芽孢杆菌对动物蹄角蛋白质降解的实验结果表明,当培养基初始pH值为8,培养温度为30℃,蹄角粉浓度为2%,接种量为1%时,最适合该菌株降解蹄角粉;而且在转速为180r/min的条件下培养3days,蹄角蛋白降解率可达45.4%;当培养7days时,蹄角蛋白降解率可达68.7%;此外,当MgSO4浓度低于1mmol/L及Na2SO4浓度低于500mmol/L时对此菌降解蹄角蛋白都具有促进作用。
通过测定粗酶液的酶活力可知,在反应体系中添加1mL500万单位/升的青霉素可以使测量结果更准确;而且反应体系的最适pH和温度分别为7.5和40℃。
研究酶的稳定性实验的结果表明,筛选到的菌株所产生的角蛋白酶在pH7.0~10.0时的稳定性较好;在保存过程中,当此酶保存在40~50℃时稳定性较好。
此外,K+、Ca2+、Na+、Mg2+对角蛋白酶粗酶液的酶活力均有一定的促进作用,其中Mg2+对酶的促进作用较大。
关键词:
蹄角蛋白;菌种筛选;鉴定;发酵条件
Abstract
Basedonthecomparisonofthedecomposingratiotothehoofandhornfarina,abacteriumwhichcanhighlydecomposethehoofandhornfarinawasfiltrated.Thedecomposingratiois45.35%,afterthisbacteriumcultured3daysat30℃.Accordingtothemorphologyandbiochemistrycharacter,theanalysisofthesequenceofthe16SrDNA,thisbacteriumwasidentifiedtobelongtotheBacillussubtilis.TheexperimentresultsoftheBacillussubtilisdecomposingthehoofandhornfarinashowtheoptimalreactioncondition.Forexample,thepreliminarypHis8.0,thetemperatureis30℃,theconcentrationofthehoofandhornfarinais2%,theinoculationratiois1%.Aftercultured3daysatthe180rpm,thedecomposingratiois45.4%.Whenculturing7days,thedecomposingratioofthisbacteriumis68.7%.Besides,thelowconcentrationoftheMgSO4andNa2SO4promotethedecomposingreaction.TheconcentrationoftheMgSO4isunder1mmol/LandtheconcentrationoftheNa2SO4isunder500mmol/L.
Theresultsoftheexperimentfortestingtheactivityoftherareenzymeindicatethatthemeasuringresultwillbemuchmorepreciseafteradding1mLpenicillin(5millionU).AndpH7.5and40℃isoptimalandrespectively.Accordingtotheresultsoftheexperimentfortestingtheenzymestability,wecanobtainthisinformation.Forexample,theoptimalpHis7.0~10.0;theoptimalsavingtemperatureis40~50℃.Besides,K+、Ca2+、Na+、Mg2+allcouldpromotetheactivityoftherareenzyme.AndtheMg2+cansignificantlypromotetheactivityoftherareenzyme.
Keywords:
keratin;thefiltratingforthebacteria;identification;fermentationcondition
第一章前言
角蛋白存在于许多脊椎动物的外骨骼结构中,如毛发、鳞片、羽毛、蹄、角、鼻和爪等,是一种坚韧的不溶性蛋白。
“硬”角蛋白(如动物的蹄和角)含硫量较高(约占干重的5%)。
“软”角蛋白(如人的表皮)含硫量较低(约占干重的1%)。
在各种动物的蹄角、毛发和羽毛中,粗蛋白浓度分别为82.8%、81.5%和87.8%;经过加工提纯后,得率分别可达39%,28%和26%。
我国拥有丰富的角蛋白资源,它们大多未被充分利用,有的甚至污染环境,造成公害。
如果物分解技术,可将其转化成为很好的资源。
目前国内外筛选出分解羽毛的菌种约有三十种左右,而分解动物蹄角蛋白的菌种却少有报道。
虽然某些羽毛分解菌对动物蹄角也有分解作用,但是效果都不好;因此分离出了一株有效分解蹄角蛋白的菌株,并进行鉴定及生理特性研究是十分必要的。
1.1角蛋白简介
角蛋白是一类不溶性的纤维状动物蛋白质,是外胚层细胞的结构蛋白;是基细胞在由生长层移向表层成为角质化细胞的过程中,不断分泌角蛋白,且其含量逐渐增加(沈同,王镜岩1990)。
角蛋白可以分为两类:
一类是α-角蛋白,另一类是β-角蛋白。
α-角蛋白是角蛋白的优势形势,由一螺旋构象的多肽构成:
三股右手α-螺旋向左缠绕,拧成一根称为原纤维的结构(α组合的超二级结构),直径为2nm;原纤维再排列成“9+2”的电缆式结构,即微纤维,直径为8nm,成百根微纤维包埋在硫含量很高的无定形基质中,结合成一不规则的纤维束,称大纤维,其直径为200nm(Jonesetal.,1976)。
α-角蛋白存在于毛发、羊毛、羽毛、指甲、蹄、角等结构中,具有很好的伸缩性能。
β-角蛋白是反平行式β-折叠片以平行的方式堆积成的多层结构,链间主要以氢键连接,层间主要靠范德华力维系,因此它的特性为抗张强度高,但不能拉伸。
β-角蛋白富含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和一些由络氨酸、脯氨酸、缬氨酸组成的大侧链,在自然界中以天然存在的蚕丝和蜘蛛丝中的丝心蛋白为代表(沈仁权,1981;张树政,1998)。
动物角蛋白具有不容于水和抗分解的性质,是一种抗性很强的硬性蛋白,其结构通过分子间二硫键、氢键、盐键和其他交键作用后具有很高的稳定性,在一般条件下不溶解,且不能被一般的蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)水解(Marshalletal.,1991)。
因此这给动物角蛋白的处理提出了难题。
动物角蛋白的电子显微镜结构如下图所示。
1.2可降解角蛋白的微生物
早在十九世纪初期,人们就发现一些生物能降解角蛋白,如衣蛾、苍鹰以及一些放线菌。
真菌能在角蛋白组织上生长,也早被人们所知晓。
目前,己发现30余种微生物可降解羽毛角蛋白(涂国全等,1989),其中有细菌(如BacilluslinchenigormiS,BacilcuSsuctilis)、放线菌(如Streptomycesspp;Thermoactinomycescandidus)和真菌(如Candidaspp.Aspergillusspp,Trichophytonspp,Microsporumspp);然而,以动物蹄角为底物进行筛菌的实验,国内外的报道都非常少。
在家禽养殖废弃物的高温厌氧消化系统中,发现了能够降解羽毛角蛋白的细菌。
进一步分离,获得了地衣杆菌(BacilluslinchenigormisPWD-1)。
以羽毛粉末为基质时,这种细菌的最适生长温度为45~50℃(Dongetal.,1993)。
具有角蛋白分解能力的细菌大都集中在地衣芽孢杆菌属。
1990年Williams等报道,从实验室废水消化器中富集分离到一株能利用羽毛的地衣芽孢杆菌属(BacilcuslincheniformisPWD-1),其降解羽毛角蛋白产物的可消化性及营养价值与饲用大豆蛋白相同。
Atal和Gashe(1993)分离到一株能降解不同纤维性蛋白的嗜热杆菌P-001A(thermophilicBacillusspeciseP-001A)。
胡介卿(1995)从鸬鹚肠道中分离到一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F5,并经过诱变育种,提高了其分解角蛋白能力。
Friedrich(1996)分离到一株利用羽毛角蛋白的嗜热厌氧菌闪光杆菌(Fervidobacteriumpennavorans)。
Noval等人发现,弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)可使自然界中的角蛋白降解(Novaletal.,1959),他们以羊毛为基质来培养放线菌,初步探明角蛋白的降解机理,提出了角蛋白复合酶说。
将从土壤中分离得到的纯白高温放线菌(Thermoactinomycescandidus)用于羊毛分解试验,发现以羊毛作为唯一碳源和氮源时能诱导角蛋白酶的合成。
尽管纯白高温放线菌的嗜热角蛋白酶与弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶DY很相似,但是具有很高的水解α-和β-角蛋白的活性。
其活性是蛋自酶k的2倍,是枯草杆菌蛋白酶DY和弹性蛋白酶的4~5倍(Josephetal.,1959)。
真菌是最早发现的能够降解角蛋白的微生物。
早在1926年,Nannizzi就提出环癣真菌可水解角蛋白。
1996年Santos发现烟曲霉可以利用羽毛角蛋白为唯一碳源和氮源生长(Santosetal.,1996),另外产角蛋白酶的真菌主要为皮肤类真菌,包括微孢长囊头孢霉菌(Gradisaretal.,2000),须癣毛癣菌(Yuetal.,1969)、外红色毛癣菌、鸡禽毛癣菌、短帚霉、石膏样小孢子菌、犬小抱子菌和白念珠菌、黄曲霉、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌及TrichophytonsimiiHN50等(Mikxetal.,1987;Singhetal.,1997;)。
国内谭盈盈等分离到拟青霉Fl和A1,并对其产酶条件进行了研究(谭盈盈,2003)。
1.3利用生物技术手段降解角蛋白的生化机制
1.3.1角蛋白降解生化机制理论
角蛋白作为一种特殊的硬蛋白,在它降解过程中二硫键的降解是最为关键的。
当二硫键被破坏以后,多肽酶即可顺利的将它分解为多肽、寡肽以及游离氨基酸。
因此,分析二硫键是如何被打开的也是重中之重。
目前有如下几种理论来解释这个问题。
在不同的微生物环境中可能有不同的降解机制,有可能使用其中的一种,也有可能几种并用,迄今仍没有系统完整的理论。
(1)物理压力理论
认为角蛋白水解最初的动力源于菌丝体的压力。
1992年Malviya观察到角蛋白的降解先于胞外角蛋白酶的分泌。
他认为这种降解与菌丝体的生长偶联,随着真菌的菌丝体的生长和延长,对于底物产生压强,菌丝体无需要识别角蛋白的连续结构,便可不断的伸入羽毛中,而这种机械的物理作用可能有助于肽键切割活性位点的暴露。
角蛋白降解在初始阶段后,便机械降解和酶解过程相互协同进行。
(2)膜电位理论
1997年BrigiteBockle和RudolfMuller研究链霉菌(Streptomycespactm)二硫键还原时指出,细胞外不溶性角蛋白的降解可能由细胞表面的膜结合氧还原体系来完成,或由分泌到培养基中的一种可溶性还原组分来完成。
膜电位或者通过还原角蛋白的二硫键,或者通过产生可溶性还原剂作用于角蛋白表面使得蛋白键更适合于蛋白酶裂解而在蛋白质降解中起着重要的作用。
(3)无机变性理论
二硫键的分开不是由某种酶来完成的,而是由亚硫酸盐作用于二硫键使之还原断裂,亚硫酸盐最终变为硫酸盐。
现在,在很多微生物最初的发酵液中可以检测到含硫代半胱氨酸残基的多肽和含巯基多肤的积累,而且随着发酵时间的延长,发酵液中的疏基化合物及亚硫酸盐的含量不断降低,取而代之的是硫酸盐。
反应方程如下:
Cys-S-S-Cys+HSO3-
Cys-SH+Cys-SSO3-
(4)复合酶理论
早在1963年,Nickerson就用来自弗氏链霉菌的角蛋白酶和胰蛋白酶对羊毛角蛋白底物进行水解对比试验,认为角蛋白酶对角蛋白的分解作用主要是通过断裂二硫键实现的,但对这一过程具体如何进行未作深入研究。
1998年涂国全等利用弗氏链霉菌S-221菌株,探讨了其分解角蛋白的生化机制。
他认为角蛋白酶是一种复合酶,其中含有特异裂解二硫键的二硫键还原酶和使多肽水解的多肽水解酶。
二硫键还原酶是角蛋白降解的关键酶,它首先作用于角蛋白分子中的结构二硫键,使角蛋白的高级结构解体形成变性角蛋白;变性角蛋白再在多肽水解酶的共同作用下逐渐水解成多肽、寡肽和游离氨基酸,使角蛋白彻底分解。
1.3.2角蛋白的酶解机理
微生物降解角蛋白的过程是一个酶解的过程,在这个过程中坚硬的、不溶的动物角蛋白是如何一步一步地被分解成可溶的短肽、氨基酸以及游离氨
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- 角蛋白 降解 选育 及其 活性 研究