实验动物病毒学讲稿内附5种实验具体步骤精.docx

实验动物病毒学讲稿内附5种实验具体步骤精.docx

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实验动物病毒学讲稿内附5种实验具体步骤精

【关键字】实验

《动物病毒学》实验课

讲稿

任课教师：

方六荣

授课对象：

2002级动物医学专业1-4班

授课时间：

2004.09-2005.01

实验一鸡胚接种…………………………………………………………1

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养………………………6

实验三原代细胞培养……………………………………………………9

实验四病毒TCID50的测定………………………………………………11

实验五中和试验…………………………………………………………13

实验一鸡胚接种

一、实验目的

了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。

2、鸡胚接种的作用

主要用于：

1分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒

2培养病毒，制造抗原和疫苗

3测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验）

4测定病毒毒力

三、材料

1、鸡胚10日龄

2、病毒鸡传染性支气管炎病毒（IBV）

3、照蛋灯

4、打孔器

5、石蜡

6、注射器

7、蛋座

8、酒精棉球、碘酊棉球

四、鸡胚用于病毒培养的优缺点

（一）优点

1、组织分化程度低

2、可选择不同的日龄和接种途径

3、病毒易于增殖

4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒

5、容易采集和处理

6、来源充足

7、设备和操作简便易行

（二）缺点

1、胚内可能污染细菌和病毒

沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒

2、母源抗体

3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针

五、鸡胚的结构与功能

1、卵壳上有细孔，进行气体交换

2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。

3、气室呼吸和调节压力

4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。

5、尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。

6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中

7、卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。

8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。

六、受精卵的选择

1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。

2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。

3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。

七、鸡胚的孵育

1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃

2、相对湿度：

50%-60%

3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后

4、从孵育后第3天开始，每天翻卵一次

八、检卵

自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。

孵育4-5日后即可于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。

未受精卵：

只见模糊的卵黄卵影，不见血管和鸡胚痕迹

活胚：

具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以后胎动不明显，甚至无胎动。

死胚：

血管昏暗模糊，没有胚动

九、接种前处理

1、用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。

2、对鸡胚进行消毒。

十、接种途径

1、绒毛尿囊膜接种

2、尿囊腔接种

3、卵黄囊接种

4、静脉接种蓝舌病毒

5、羊膜腔接种正粘病毒和副粘病毒

6、脑内接种狂犬病毒

7、眼球接种

（一）卵黄囊接种法

主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。

方法一：

1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上（大头向上）

2）用碘酊和酒精消毒气室端

3）用钢锥在气室中央锥一小孔

4）用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。

5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。

方法二：

1）2）同一

3）将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。

在卵长径的1/2处用碘酊和酒精消毒。

4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm，注入病毒液0.1-0.5ml

5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，24h内死亡者废弃

（二）绒毛尿囊膜接种

主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。

方法一：

1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒

2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口

3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜

4）滴入接种物

5）用胶布或透明胶纸封闭切口

方法二：

（要做人工气室）

1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。

2、用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。

3、在气室端中央钻一个小孔。

4、用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。

5、用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。

6、用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。

7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。

8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。

（三） 尿囊腔接种

主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病毒、新城疫病毒的分离和增殖。

1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位

2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒

3、用钢锥穿一小孔

4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接种物

5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。

十一、传染性支气管炎病毒（IBV）接种鸡胚后对鸡胚的影响

IBV一般采用尿囊腔接种

最初几代鸡胚极少发生变化，随着传代次数的增加，鸡胚死亡率增高，鸡胚病变明显，至第10代时，可使80%鸡胚死亡。

病变：

1、鸡胚停止生长，卷曲呈球形，即所谓卷曲胚。

2、羊膜水肿增厚，紧贴鸡胚，尿囊液增量，卵黄囊皱缩，肾中尿酸盐沉着，鸡胚发生肝坏死、肺炎和肾炎。

3、病毒经尿囊腔接种后36h，最高滴度可达107个鸡胚致量。

十二、收毒

收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。

根据接种途径的不同，收获相应的材料

1、绒毛尿囊膜接种收获接种部位绒毛尿囊膜

2、尿囊腔接种收获尿囊液（5-8ml）

3、卵黄囊接种收获卵黄囊或胚体

4、羊膜腔接种收获羊水（0.5-1ml）

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养

一、实验目的

了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。

二、常用细胞的种类

BHK-21：

仓鼠肾传代细胞

PK-15：

猪肾传代细胞

IBRS-2：

猪肾传代细胞

Hela：

人的子宫瘤细胞

Vero：

非洲绿猴肾细胞

Marc-145：

来源于Vero细胞

TK-143：

人的胸苷激酶阴性细胞

Sf9：

昆虫细胞

三、材料

1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头

2、BHK-21（babyhamsterkidney）细胞

3、0.25%胰酶

4、生长液：

含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

维持液：

含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

5、伪狂犬病病毒液（PRV）

四、传代细胞培养的条件要求

1）细胞密度：

2-3×105个/ml

2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8

3）培养温度

哺乳动物细胞一般为37℃

昆虫细胞28-30℃

五、常用细胞分散剂与作用原理

1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：

与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶：

由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。

六、营养液

1、人工综合营养液

氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2、血清

1）血清的种类

胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2）血清的处理

无菌采集，过滤除菌。

用前56℃灭活30min。

3）血清的作用

A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。

B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。

C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。

D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。

E、给培养液提供良好的缓冲系统。

F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。

4）应用血清存在的问题

A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：

补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。

B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。

C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。

七、传代细胞系培养

1、优点：

1）可以无限的传代。

2）不少细胞系对病毒很敏感。

3）某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。

4）生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。

2、缺点：

在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。

3、培养方法

1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。

2）加入2ml胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。

3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。

再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。

八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养

1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。

2、加入适量的病毒悬液

3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。

4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。

5、收毒：

将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。

然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。

低温贮藏备用。

实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）

一、实验目的

了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。

二、材料

1、9-11日龄鸡胚

2、照蛋灯与蛋座

3、碘酊棉球与酒精棉球

4、大剪子、眼科剪、小镊子

5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、

6、胰酶、生长液、维持液

三、细胞培养的条件要求

1）细胞密度

原代细胞：

4-6×105个/ml

传代细胞：

2-3×105个/ml

2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8

3）培养温度

哺乳动物细胞一般为37℃

昆虫细胞28-30℃

四、操作步骤

1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。

2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。

3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。

4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。

5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。

如此反复冲洗2-3遍。

6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。

7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。

8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。

9、细胞计数

取细胞悬液0.5ml+2ml0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。

按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。

每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。

活细胞数应在90%以上。

10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。

○表示可计数

●表示不计数

五、结果的观察

于培养后每天观察结果，至长层单层。

细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。

实验四病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50（50%lethaldose）：

用动物或鸡胚来检测

半数鸡胚感染量EID50（egg50%infectivedose）：

用鸡胚来检测

半数细胞培养物感染量TCID50（50%tissuecultureinfectivedose）：

用细胞来检测

蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：

用细胞来检测

三、材料

1、长满单层的细胞1瓶

2、胰酶、吸球、吸管、生长液

3、96孔细胞培养板

4、加样器、枪头

5、病毒液（PRV）

四、TCID50的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100µl。

3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

（100µl生长液+100µl细胞悬液）

5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法

五、TCID50的计算方法

1、Reed-Muench两氏法

病毒液稀释度

出现CPE孔数

无CPE孔数

累计

出现CPE孔所占的%

CPE孔数

无CPE孔数

10-1

8

0

27

0

100（27/27）

10-2

8

0

19

0

100（19/19）

10-3

7

1

11

1

91.6（11/12）

10-4

3

5

4

6

40（4/10）

10-5

1

7

1

13

0.7（1/14）

10-6

0

8

0

21

0（0/21）

CPE：

Cytopathiceffect

距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）

 ＝（91.6-50）/（91.6-40）

＝0.8

lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数

=0.8×（-1）+（-3）

=-3.8

TCID50=10-3.8/0.1ml

含义：

将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。

2、Karber法

病毒液稀释度

出现CPE的孔数

出现CPE孔的比率

10-1

8

8/8=1

10-2

8

8/8=1

10-3

7

7/8=0.875

10-4

3

3/8=0.375

10-5

1

1/8=0.125

10-6

0

0/8=0

lgTCID50=L-d（s-0.5）

L：

最高稀释度的对数

D：

稀释度对数之间的差

S：

阳性孔比率总和

lgTCID50=-1-1×（3.375-0.5）

=-3.875

TCID50=10-3.875/0.1ml

含义：

将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。

实验五血清中和试验

一、实验目的

了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。

二、原理

抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。

三、用途

1、疾病诊断

2、病毒分离株的鉴定

3、不同病毒株的抗原关系研究

4、疫苗免疫原性的评价

5、免疫血清的质量评价

6、测定实验动物血清中是否存在抗体

四、分类

（一）蚀斑（痘斑）减数试验

将病毒—正常血清混合物以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒—正常血清组和病毒—待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。

以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。

（二）交叉保护试验

先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。

这一方法的缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。

可用于以下几方面：

应用已知V鉴定未知V；应用已知免疫血清鉴定未知V；应用已知V鉴定未知血清。

（三）终点法中和试验

1、固定病毒—稀释血清法

将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID50、EID50或LD50）混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。

以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD50）。

2、固定血清——稀释病毒法

在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。

五、材料

1、长满单层的细胞1瓶

2、胰酶、吸球、吸管、生长液

3、96孔细胞培养板

4、加样器、枪头

5、病毒液（PRV）

6、待检血清、PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清

六、操作步骤

1、固定病毒—稀释血清法

1）测定病毒液的TCID50

2）将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。

3）在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50µl生长液，再加50µl待检血清，混匀后，吸50µl至下一孔，如此下去。

一直到1∶256），每个稀释度作4孔。

4）在上述各孔内加入50µl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃5%CO2培养箱中作用45min-60min。

5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要作200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID504个不同浓度的对照。

6）感作完成后每孔加入100µl细胞悬液，放37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。

7）结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。

血清稀释度

CPE孔数

无CPE孔数

累计

保护率%

CPE孔数

无CPE孔数

1∶2（10-0.3）

0

4

0

15

100（15/15）

1∶4（10-0.6）

0

4

0

11

100（11/11）

1∶8（10-0.9）

1

3

1

7

87.5（7/8）

1∶16（10-1.2）

1

3

2

4

66.7（4/6）

1∶32（10-1.5）

3

1

5

1

16.7（1/6）

1∶64（10-1.8）

4

0

9

0

0（0/9）

1∶128（10-2.1）

4

0

13

0

0（0/13）

1∶256（10-2.4）

4

0

17

0

0（0/17）

距离比例=（高于50%的保护率-50%）/（高于50%的保护率—低于50%的保护率）

=（66.7-50）/（66.7-16.7）

=-1.2+0.33×（-0.3）

=-1.299

lgPD50=高于50%的保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差

PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20

=0.33

即1∶20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。

2、固定血清——稀释病毒法

1）将病毒作连续10倍稀释

2）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl，做两块板子。

在其中一块板子的每孔加入50μl待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl正常血清（对照组），混合后置37℃5%CO2培养箱作用1h。

3）然后在每孔中加入100μl细胞悬液。

4）设两纵排正常细胞对照。

5）置37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。

6）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。

中和指数=试验组TCID50/对照组TCID50

如：

中和指数=10-4.0/10-7.0=103.0=1000

判定标准：

以待检血精的中和指数大于50者，判为阳性；10-49为可疑；小于10为阴性。

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