氟化钠的毒性评价试验.docx
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氟化钠的毒性评价试验
2015
PKUHSC
2015-5-14
氟化钠的毒性评价试验
氟化钠的毒性评价实验
氟化钠,英文通用名称为Sodiumfluoride,分子式为NaF,分子量为41.99。
白色粉末,易溶于水,水溶液显碱性,对玻璃有腐蚀性。
熔点993℃,沸点1700℃,溶解性4g/100mL(25℃),有毒。
主要应用于杀虫剂和木材防腐剂。
对害虫为胃毒作用,对作物有药害,只能用于防治蜚蠊、衣鱼、蚂蚁、白蚁等,现已很少使用。
还可用于氟化饮水防止龋齿(用量以NaF计为1.5~2.2mg/L),用作血的防腐剂,和骨疾病治疗也用作沸腾钢脱氧的助熔剂,机械刀片和刨刀片的镶钢,以增强焊接强度,以及用于造纸和冶金行业。
相关毒理学资料显示,急性毒性试验:
LD50为52mg/kg(大鼠经口)、57mg/kg(小鼠经口)LD50180~250mg/kg;刺激性:
家兔经皮500mg(24小时),引起重度刺激;亚急性和慢性毒性:
大鼠以含氟化物7~9ppm的饲料连续喂养可引起牙钙化障碍,剂量增大则致骨骼改变;致突变性:
微生物致突变:
鼠伤寒沙门氏菌1mg/皿:
细胞遗传学分析:
人成纤维细胞20mg/L;生殖毒性:
大鼠经口最低中毒剂量(TDL0):
240mg/kg(孕11~14天),肌肉骨骼发育异常;致癌性:
IARC致癌性评论:
人不明确。
对人体的健康危害的侵入途径有吸入、食入,产生的健康危害主要有急性中毒:
多为误服所致。
服后立即出现剧烈恶心、呕吐、腹痛、腹泻。
重者休克、呼吸困难、紫绀。
如不及时抢救可致死亡。
部分患者出现荨麻疹,吞咽肌麻痹,手足抽搐或四肢肌肉痉挛。
短期内吸入大量本品粉尘,引起呼吸道刺激症状,并伴有头昏、头痛、无力及消化道症状;慢性影响:
长期较高浓度吸入可引起氟骨症。
可致皮炎,重者出现溃疡或大疱。
第一部分氟化钠的急性毒性试验
本部分包括霍恩氏法(horn’s)和简化寇氏法两部分,将受试物(氟化钠)以不同剂量经口给予实验动物,以实验动物死亡作为观测终点,依据剂量-反应关系,经过统计学方法处理求得受试物的致死剂量,并计算出引起实验动物群体半数动物死亡的剂量,即LD50。
霍恩氏法(horn’s)
一、实验动物
健康的成年ICR小鼠,体重18~25g,由北京大学医学部毒理学系实验室于实验前准备。
自由摄食饮水。
二、试剂与器材
氟化钠、苦味酸酒精饱和液、蒸馏水、一次性注射器(1.0ml)、吸量管(1ml、2ml、5ml)、容量瓶(25ml、50ml)、烧杯(10ml、50ml)、吸管、小鼠、灌胃针、动物称、洗耳球、滤纸。
三、实验方法
1.实验动物的分组:
采用配伍组设计法,即将小鼠按体重从小到大排序,编成4个配伍组,即1-5号为第一配伍组,6-10号为第二配伍组,依此类推。
由随机数码表,随机指定4行,每行只取随机数字1-5,其余舍去,依次标记于各配伍组的小鼠编号下,每只小鼠号下面的随机数字即为该小鼠应分入的实验组。
详见表1-1。
根据实验结果补充最高剂量组(464mg/kg)动物编号和体重,详见表1-2
表.1-1
体重(g)
17.9
19.3
19.3
19.5
19.8
20.1
20.2
20.6
20.7
20.8
编号
10
3
14
13
15
4
12
17
5
1
随机数
5
1
4
3
2
2
5
1
4
3
体重(g)
21.4
21.5
21.8
22.0
22.1
23.0
23.0
23.2
24.1
24.6
编号
6
24
8
7
18
2
16
19
23
9
随机数
1
2
3
4
5
1
5
4
3
2
表1-2
体重(g)
22.2
21.5
21.3
22.3
编号
25
26
27
28
表1-3整理后的20只小鼠随机区组结果
组别
动物编号
剂量(mg/kg)
1
2
3
6
17
215.0
2
4
9
15
24
100.0
3
1
8
13
23
46.4
4
5
7
14
19
21.5
5
10
12
16
18
10.0
6
25
26
27
28
464.0
2.剂量设计:
利用组距为2.15的剂量系列进行试验,选择剂量为215.0、100.0、46.4、21.5、10.0、464.0mg/kg体重作为受试剂量。
受试物浓度(mg/ml,c)由单位体重给药剂量(mg/kg,d)和单位体重给药体积(ml/kg,v)决定,即c=d/v。
组1到组6给药浓度分别为21.50、10.00、4.64、2.15、1.00、46.40mg/ml。
3.动物处理和观察:
对组1→组6的小鼠采用灌胃法给药。
灌胃后即观察小鼠反应,并详细记录小鼠的各种中毒反应,反应出现的时间、强度、动物的死亡构成和死亡时间,死亡动物应解剖观察各个主要脏器有无异常变化。
将观察结果整理成记录表格。
急性毒性试验的观察期限一般为14天,但本实验由于时间限制,仅限课堂观察及实验后第三日的老师的结果反馈,即72小时后统计各组小鼠死亡情况。
四、结果
1.第6组实验情况如表1-4所示
表1-4.第6组染毒结果
小鼠编号
25
26
27
28
体重(g)
22.2
21.5
21.3
22.3
给药(ml)
0.444
0.430
0.426
0.446
给药时间
14:
49
14:
52
14:
51
14:
54
症状出现时间
14:
53
14:
58
14:
55
14:
57
死亡时间
14:
56
17:
55
14:
57
15:
03
2.各实验组小鼠死亡情况见表1-5所示
表1-5.死亡结果
组别
第一组
第二组
第三组
第四组
第五组
第六组
死亡
1
0
0
0
0
4
五、结论:
实验动物出现淡漠、抽搐、瘫痪、步态不稳等毒性反应,少数致死。
由于第二至第五组小鼠均无死亡,可知第四、五组数量远低于致死剂量,可丢弃第四、五组的数据,利用剩余四组的数据查表,死亡数0、0、1、4,表中未给出相应LD50。
六、讨论:
1.利用霍恩氏(horn’s)法用来进行对受试物的LD50的初步测定以及估算LD0和LD100,具有较为经济简便,耗费较少的小鼠,并且结果计算较为简单等优点。
但由于实验过程较为简单以及结果计算是通过查表获得等原因,本实验设计有实验结果不够精确,以及有可能出现查表无法得到具体精确LD50值等缺点。
2.本次试验结果并不理想,没有明显的剂量反应关系。
由于是分组实验,实验过程中非处理因素差异较大,而且在实验过程中,由于部分操作者灌胃不太熟练,操作过程中对小鼠造成致命的损伤,可能会产生一定影响,这里数据处理时并未将其放置死亡数内,由于实验动物少,造成较大的偏倚。
3.由于第二组到第五组全部实验动物无死亡,考虑是否剂量设计的浓度梯度太小,而氟化钠LD0与LD100差距很大,或者最低剂量太低,以致有效实验结果减少,因此可增大浓梯度和最大剂量再次试验进行验证。
4.本实验没有得到氟化钠的LD50初测值,简化寇氏法实验需重新设定剂量组。
简化寇氏法
一、实验动物
健康的成年ICR小鼠40只,体重18~25g,雌雄各半,由北京大学医学部毒理学系实验室于实验前准备。
自由摄食饮水。
二、试剂与器材
氟化钠、苦味酸酒精饱和溶液、蒸馏水、一次性注射器(1.0ml)、吸量管(1ml、2ml、5ml)、容量瓶(25ml、50ml)、烧杯(10ml、50ml)、吸管、小鼠灌胃针头、动物称、洗耳球、滤纸。
三、实验方法
1.实验动物的分组:
采用配伍组设计法,雄性小鼠分组结果详见表2-1,雌性小鼠分组结果详见表2-2。
最终分组情况详见表2-3。
表2-1
体重(g)
22.2
22.3
23.5
23.5
23.8
24.0
24.0
24.4
24.4
24.5
编号
36
58
37
49
27
35
56
38
45
46
随机数
5
1
4
3
2
2
5
1
4
3
体重(g)
24.8
25.2
25.3
25.5
25.5
25.8
26.2
26.5
26.5
27.2
编号
47
26
28
25
39
48
59
29
57
34
随机数
1
2
3
4
5
1
5
4
3
2
表2-2
体重(g)
16.4
16.4
16.6
16.6
16.8
17.2
17.4
17.4
18.1
18.2
编号
5
6
16
17
15
1
19
23
2
9
随机数
5
1
4
3
2
2
5
1
4
3
体重(g)
18.2
18.2
18.2
18.5
18.9
18.9
19.1
19.8
21.5
24.5
编号
10
12
18
13
3
4
14
24
7
8
随机数
1
2
3
4
5
1
5
4
3
2
表2-3
组别
小鼠编号
mg/kg
雌性小鼠
雄性小鼠
464.0
6
23
10
4
58
45
47
48
341.2
15
1
12
8
27
35
26
34
250.9
17
9
18
7
37
46
28
57
184.5
16
2
13
24
49
38
39
29
135.7
5
19
3
14
36
56
25
59
2.实验动物的处理:
利用霍恩氏法得出的大致LD0、LD100及剂量组数n=6,选择合适的剂量组间的组距i为1.36。
选择剂量为464.0、341.2、250.9、184.5、135.7、99.8mg/kg体重作为受试剂量,灌胃量0.2ml/10g。
组A→组F给药浓度分别23.20、17.05、12.55、9.23、6.79、4.99mg/ml。
3.灌胃观察:
先做组A至组E,灌胃后即观察小鼠反应,并详细记录小鼠的各种中毒反应,反应出现的时间、强度、动物的死亡构成和死亡时间,死亡动物应解剖观察各个主要脏器有无异常变化。
若组E的死亡率在25%以内,则不用做99.8mg/kg剂量组,否则应该补充此剂量组实验。
将观察结果整理记录表格。
本次实验同样限于课堂观察,于2小时后统计各组小鼠死亡情况。
四、结果及分析
1.观察小鼠反应,于2小时后记录各组小鼠死亡情况,详细结果见下表2-4。
实验中共有7只小鼠为异常死亡,未将其用于分析,对其进行补充实验,并将结果记录。
表2-4.小鼠死亡情况
组别
剂量(mg/kg)
小鼠死亡数目
死亡率(%)
第一组
464.0
7
87.5
第二组
341.2
7
87.5
第三组
250.9
1
12.5
第四组
184.5
2
25
第五组
135.7
2
25
第六组
99.8
0
0
2.按照下述公式计算受试物(氟化钠)的LD50。
lgLD50=Xm−i(Σp-0.5)Xm:
最大剂量的对数值
i:
相邻两剂量比值的对数
Σp:
各剂量组动物死亡率总和
SlgLD50=i√∑piqi/npi:
各组动物死亡率
qi=1-pi
n:
各组动物数
LD50的95%可信限区间:
lg−1(lgLD50±1.96SlgLD50)
代入数据得:
LD50=224.9mg/kg,95%置信区间为(107.0,472.7)。
五、结论:
1.实验过程中小鼠出现静默、后肢无力、抽搐等毒性反应。
2.LD50=224.9mg/kg,95%置信区间为(107.0,472.7)。
3.根据简化寇氏法结果,参照《毒理学教程》(周宗灿主编,北大医学出版社,第三版)第739页全球化学品统一分类和标签制度(GHS)WHO/GHS·2005中急性毒性危害类别和急性毒性估计(ATE)值(表3)认为氟化钠为第三类毒物。
六、讨论:
1.利用简化寇氏法进行氟化钠的急性毒性实验,其实验过程比霍恩氏法复杂,且消耗实验动物较多,但其实验结果通过统计学方法计算获得,结果准确度和可信度比较高。
2.本次实验中,最低剂量组作为机动组,参考其余组实验结果,进行补充实验,对实验结果的计算准确性有一定贡献。
3.本次实验剂量反应关系依旧不明显,这可能与操作者灌胃技术不到位,个别小鼠的特异性差别比较大有关。
但较之前一次实验,结果较理想,基本得出了氟化钠小鼠经口LD50及其置信区间。
第二部分氟化钠的遗传毒性试验
本部分试验主要包括AMES实验、小鼠骨髓多染红细胞微核实验和单细胞凝胶电泳三个遗传毒理学实验,并由此对氟化钠的遗传毒性进行评价。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变(AMES)实验
鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验,即Ames实验,是检测原核生物回复突变的遗传毒理学体外实验,遗传学终点是基因突变。
用于检测受试物是否能引起鼠伤寒沙门氏菌基因组碱基置换或移码突变。
本实验的原理是利用鼠伤寒沙门氏菌的突变型即组氨酸缺陷型作为指示生物,这些菌株在无组氨酸的培养基上不能生长,在有组氨酸的培养基上可以正常生长。
致突变物可使沙门氏菌突变为野生型(his+),恢复了合成组氨酸能力,因而在无组氨酸培养基上也能生长为可见菌落。
故可根据在无组氨酸培养基菌落生成数量,检查受试物是否为致突变物。
对于间接致突变物,可用经Aroclor1254(或多氯联苯)诱导的大鼠肝匀浆制备的S9混合液作为代谢活化系统。
一、试剂和器材
1.仪器和试剂
低温高速离心机,低温冰箱,洁净工作台,恒温培养箱,恒温水浴,蒸汽压力锅,匀浆器等实验室常用设备。
2.培养基和试剂
四种试验菌株的肉汤培养物、最低葡萄糖平皿、肉汤平皿、顶层琼脂、0.5mmol/L组氨酸/0.5mmol/L生物素、0.1mol/L组氨酸/0.5mmol/L生物素、0.1%结晶紫水溶液、氨苄青霉素1mg/ml(0.02mol/LNaOH)、四环素0.08mg/ml(0.02mol/LNHCl)、叠氮钠10mg/ml(灭菌水)。
3.菌株TA97、TA98、TA100、TA102
二、实验设计
限于实验条件的限制,本次实验正式实验只用TA97进行对氟化钠的直接致突变性证实。
1.四种试验菌株的鉴定
①基因型鉴定:
组氨酸需求试验、结晶紫敏感试验、紫外线敏感试验、氨苄青霉素抗性(R因子)试验和四环素抗性(pAQ1质粒)试验。
按照下图所示进行划线或涂带。
图3-1图3-2图3-3
②四种试验菌株自发回变数测定。
取底层培养基三个,取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2ml),加入测试菌菌液后迅速混匀,平铺于底层培养基上,平放固化。
37℃培养48h,计数回变菌落数。
2.叠氮钠对TA100菌株直接致突变性作为阳性对照①用TA100菌株的肉汤培养物,不加S9混合液,使用点试法,配置10、5、2.5、1.25、0.625mg/ml,每个滤纸片上滴相应剂量的试剂5μl,以观察叠氮钠对TA100菌株直接致突变性的剂量-反应关系。
3.氟化钠以平板掺入法加入,每皿剂量分别为2、1、0.5、0.25、0.125mg,分别配置20、10、5、2.5、1.25mg/ml溶液,取0.1ml加入顶层培养基中(2ml),再加入TA97菌液0.05ml。
迅速混匀后倒在底层培养基上,转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上。
待平板固化后(约10min),将所有的试验平皿翻转后,置于37℃孵箱内培养48小时,观察结果。
三、结果
表3-1菌株鉴定和自发回变数
菌种
基因型
自发回变数
HB需要
Rfa鉴定
抗氨苄青霉素
抗四环素
ΔUrvb修复
1
2
3
平均
TA97
+
+
+
-
+
90
81
78
83
TA98
+
+
+
-
+
30
26
32
29
TA100
TA102
+
+
+
+
-
170
191
186
182
注:
+表示需要组氨酸
+表示有抑制带
+表示具有R因子
+表示具有pAQ1质粒
+表示无修复能力
表3-2TA97菌株对氟化钠致突变性的反应
NaF剂量(mg/皿)
平皿1
平皿2
平皿3
平均值
2
79
86
90
87
1
78
83
722
77
0.5
72
74
70
72
0.25
110
96
121
106
0.125
72
81
90
81
四、结论:
1.TA100菌株均未生长,其他菌株的鉴定结果及自发回变数符合预期。
2.根据实验结果可得,氟化钠作为受试物的各个剂量的平皿回变菌落数均无明显增加,更无剂量反应关系(用SPSS进行线性回归分析得P=0.867>0.05,不满足线性关系),因此认为氟化钠的Ames试验结果为阴性,即氟化钠不是鼠伤寒沙门氏菌的间接致突变物。
五、讨论
1.本次试验操作要求高,且需无菌操作,有个别平皿被污染,影响实验结果。
2.TA100菌液培养的细菌均无生长,可能是菌液质量问题2,导致无法观察到叠氮钠的致突变效果以及TA100的鉴定和自发回变
3.实验过程中,由于铺平皿不够迅速,导致有阶梯状琼脂形成,对最后的计数有影响。
小鼠骨髓多染红细胞微核试验
微核(Mironucleus)是由细胞分裂末期滞留的染色体片段或整条迟滞的染色体在分裂间期的子代细胞包浆内形成的游离团块物质。
微核实验作为细胞遗传损伤的指标之一,可用于染色体断裂剂和纺锤体损伤剂的检测。
当骨髓成红细胞发展成为红细胞时,主核排出,成为多染红细胞(polychromaticerythrocyte,PCE),这些细胞保持其碱性约24小时,然后成为正染红细胞(normochromaticerythrocyte,NCE),并进入外周血中,在主核排出时,已形成的微核可留在胞浆中。
因为在这些细胞中没有主核,便于观察微核。
观察并计数多染红细胞中的微核,可反映染色体断裂和纺锤体损伤情况。
本次试验的检测终点为染色体损伤。
一、实验动物
健康的成年ICR小鼠,体重18-21g左右,条件所限,每组5只。
二、试剂与器材
受试物:
氟化钠、阳性对照物:
环磷酰胺、丝裂霉素C、三亚乙基密胺、甲磺酸乙酯、乙基亚硝基脲、小牛血清(使用前pH调至6.4)、甲醇、磷酸缓冲液、Giemsa(吉姆萨)染液:
用时,将Giemsa原液用pH6.4的磷酸缓冲液1:
10稀释一次性注射器(1.0ml)
小鼠灌胃针头、动物秤、滤纸、剪刀、镊子、0.25ml注射器、5号针头、纱布、载玻片、染色盘、染色架、固定用染色缸、显微镜等。
三、实验方法
1.实验动物分组:
采用配伍组设计法,分组结果详见表4-1。
表4-1小鼠体重及分组体重(g)
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
12
13
体重
14.9
17.4
15.9
17.0
17.8
16.5
16.4
16.8
17.3
17.8
18.1
17.5
组别
五
一
四
三
二
二
五
一
四
三
一
二
编号
14
15
16
17
18
19
23
24
25
26
27
28
29
体重
17.8
19.0
16.9
18.0
18.9
17.2
15.8
18.0
16.2
16.1
17.2
17.4
16.8
组号
三
四
五
一
五
四
三
二
一
二
四
五
三
2.剂量分组:
设置阳性对照组、阴性对照组、高中低剂量组,阳性对照物采用环磷酰胺(80mg/kg),阴性对照物使用双蒸水。
高中低剂量组的剂量分别为氟化钠LD50的1/2、1/4、1/8,即112、56、28mg/kg体重,详见表4-2。
表4-2微核试验剂量
组号
处理
灌胃试剂
剂量
一
阴性对照组
水
二
受试物剂量组
高剂量组
112.mg/kg
三
中剂量组
56mg/kg
四
低剂量组
28mg/kg
五
阳性对照组
环磷酰胺
80mg/kg
3.染毒途径:
经口灌胃途径染毒,灌胃量0.1ml/10g。
4.染毒次数及骨髓采样时间:
一次染毒,24小时后取样测定。
5.取材:
染毒24小时后,颈椎脱臼处死动物,仔细剥离并取下一侧后肢股骨。
用纱布擦净碎肉,减去股骨两端,露出骨髓腔,用1ml的注射器吸取少量小牛血清(约0.02,ml)冲洗骨髓腔数次,冲洗物滴在玻片上。
6.制片:
蘸取骨髓液,推片3张,干燥后取其中较好的两张用甲醇固定2分钟。
7.染色:
用1:
10的Giemsa-磷酸缓冲液(pH=6.8)染色约25分钟,自来水冲洗后,自然干燥。
8.镜检:
每只小鼠选择一张染色最成功的片子,低倍镜下观察染色及细胞分散情况,再在油镜下计数200个红细胞,计算多染红细胞(PCE)在总红细胞(PCE+NCE)中的比例,作为细胞毒性的指标。
每例样本计数500个多染红细胞,记录有微核的细胞数。
四、结果与分析
实验结果详见表4-3、表4-4
表4-2各组有微核细胞数
组别
各组小鼠有微核细胞数
平均微核细胞率(‰)
1
2
3
4
5
阴性
0
0
0
0
0
0
低剂量
0
0
1
0
0
0.4
中剂量
1
0
1
0
1
1.2
高剂量
4
3
0
1
0
3.2
阳性
5
5
10
15
9
17.6
表4-4多染红细胞在总红细胞中的比例
组别
多染红细胞个数/比例(%)
1
2
3
4
5
阴性
99/49.5
115/57.5
114/57.0
105/52.5
160/80.0
低剂量
130/65.0
89/44.5
122/61.0
131/65.5
120/60.0
中剂量
79/39.5
98/49.0
93/46.5
110/55.0
150/75.0
高剂量
62/31.0
154/77.0
116/58.0
161/80.5
117/58.5
阳性
90/4
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