产内酰胺水解酶菌株的筛选及发酵条件研究精.docx
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产内酰胺水解酶菌株的筛选及发酵条件研究精
46卷 4期
2006年8月4日
微生物学报
ActaMicrobiologicaSinica
46(4:
571~5754August2006
基金项目:
国家“973项目”
(2004CB719606;微生物资源国家重点实验室开放项目(0410143
通讯作者。
Tel:
86-10264437505;E-mail:
zhenggj@,wangjj@
作者简介:
李海泉(1979-,男,河北省易县人,硕士研究生。
E-mail:
lih928@1631com收稿日期:
2005-10-17;接受日期:
2005-11-07;修回日期:
2006-04-30
产γ-内酰胺水解酶菌株的筛选及发酵条件研究
李海泉1
苏 磊1
杨 柳2
王建军
23
郑国钧
13
(1北京化工大学制药工程系 北京 100029
(2中国科学院微生物研究所微生物资源国家重点实验室 北京 100080
摘 要:
(-γ-内酰胺是合成两种抗艾滋病药物(-carbovir和(-abacavir的重要原料,具有重要的应用价值,微生物酶法拆分(+Π-γ-内酰胺生产(-γ-内酰胺的方法具有良好的应用前景。
以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源,从土壤中筛选得到了69株具有酰胺水解酶活性的菌株,利用液相色谱分析方法确定了其中20株有较高的酰胺水解酶活性,利用手性色谱分析的方法进一步得到了一株具有较高立体选择性,能拆分(+Π-γ-内酰胺而获得(-γ-内酰胺的菌株L29-9,对该菌株的产酶培养基的碳、氮源及初始pH值等进行了研究。
结果表明:
当选择碳源柠檬酸
2gΠL、氮源酵母提取物5gΠL、pH710、培养时间40h时,通过完整细胞转化,在30℃下经过12h的反应,产物(-γ-内
酰胺产率达40%,ee值9915%。
关键词:
γ-内酰胺;2-氮杂双环-[21211]-庚烷-5-烯-3-酮;拆分
中图分类号:
Q936 文献标识码:
A 文章编号:
000126209(20060420571205
(-abacavir(图1:
A和(-carbovir(图1:
B是
两种强力的抗艾滋病药物,这两种手性药物均能以(-2-氮杂双环-[21211]-庚烷-5-烯-3-酮(即(-γ-内酰胺,图1:
C为原料进行合成
。
图1 A:
(-abacavir;B:
(-carbovir;C:
(-γ-内酰胺
Fig.1 A:
(-abacavir;B:
(-carbovir;C:
(-γ-lactam.
FranciscoVelazquez等[1]
首先对(-γ-内酰胺的
不对称合成法进行了研究,但该方法原料昂贵,步骤烦琐,成本较高,不利于工业化生产。
而微生物酶法拆分具有反应条件温和、立体选择性好、易于纯化、且不污染环境等优点,在本文中我们拟以微生物酶
促动力学拆分的方法对(+Π-γ-内酰胺进行生物转化研究。
国外许多科学工作者进行了有关(+Π-γ-内酰胺进行生物转化的实验,并取得了良好的效果。
NakanoHiroto等[2]
报导了利用脂肪酶拆分(+Π-γ2内酰胺的成果,他们利用脂肪酶作用于γ2内酰胺的外消旋体,由于脂肪酶的立体选择性,它只水解消旋体中的一种,从而达到了拆分;Talor
Stephen[3]
等利用内酰胺酶对拆分(+Π-γ-内酰胺
的效果进行了研究,他们通过完整细胞转化实验,达到了良好的拆分效果,并分离得到了两种分别可以专一性水解一种对映体的酶;Brabban
[4]
和
Mahmoudian等[5]
用乙酰苯丙氨酸为唯一碳源筛选得
到了产γ-内酰胺酶菌株;Talor等[6]将微生物完整细
胞用在外消旋体的拆分上也取得了很好的效果,ee
值(对映体过量值可达到98%以上;Toogood等[8]
则
克隆了嗜热的Sulfolobussolfataricus菌株中的酰胺酶
基因,并分离得到了γ-内酰胺酶,此酶热稳定性强,催化γ-内酰胺水解反应有很高的选择性。
目前尚未查到国内相关研究的报导,能应用生产的用于生物转化的菌株也没有。
为对该方法进行进一步研究,我们拟以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源,从土壤中筛选具有较高立体选择性,拆分(+Π-γ-内酰胺而得到(-γ-内酰胺的菌株。
以N-乙
酰苯丙氨酸为唯一碳源进行产γ-内酰胺菌株的筛选方法比较成熟,在文献[3]、[4]及[6]中均有用到。
N-乙酰苯丙氨酸的结构如图2所示,其结构与γ-内酰胺相似,在生长中能利用N-乙酰苯丙氨酸为碳源的菌株,一般含有酰胺水解酶,能水解γ-内酰胺的机率也很大,这正是本文也选择N-乙酰苯丙氨酸作为唯一碳源筛选目标菌株的基础。
我们筛选得到了
一株具有较高立体选择性,能选择性水解(+γ-内
酰胺,从而拆分(+Π-γ-内酰胺而得到(-γ-内酰胺的菌株L29-9,并以此为对象进行了简单的发酵条件研究
。
图2 N-乙酰苯丙氨酸
Fig.2 N-actylphenylalanine.
1 材料和方法
111 材料
11111 菌种:
从实验室保存的土样及从北京若干地
方采集的土样中分离,共约800株。
11112 主要试剂和仪器:
消旋(+Π-γ-内酰胺为ACROS分析纯,乙酰苯丙氨酸为实验室自制,酵母提
取物、胰蛋白胨为Oxiod公司产品,甲醇为天津协合公司色谱纯,乙腈为ACROS色谱纯,其余为市售分析纯。
紫外可见光分光光度计为722型;高效液相色谱仪为Waters600E型;液相C8色谱柱为Kromasil公司产品;手性液相色谱柱为Daicel公司产品。
11113 培养基:
①筛选培养基:
每升含Na2HPO4・12H2O115g;KH2PO4115g;MgSO4・7H2O012g;CaCl2・2H2O10mg;FeSO4・7H2O7mg;ZnSO4011mg;NH4Cl2g;乙酰苯丙氨酸3g;琼脂粉15g,pH值为710,105kPa灭菌30min。
②菌株保存培养基(斜面:
每
升中除筛选培养基中成分不变外加如下成分:
酵母提取物011g,可溶性淀粉011g,胰蛋白胨011g。
③液体产酶培养基
[3]
:
每升含Na2HPO4・12H2O7g;
KH2PO42g,MgSO4・7H2O014g;CaCl2・2H2O10mg;FeSO417H2O8mg;NH4Cl2g;乙酰苯丙氨酸3g;葡萄
糖5g,pH值为710,分装入大试管每个5mL,105kPa灭菌30min。
112 土壤中菌株的筛选
环境土样用无菌水梯度稀释后涂布于筛选培养基,30℃培养;平板在2~4d后可观察到菌株生长,挑单菌落保存在培养基斜面上,菌株在2~4d后陆续生长,取出并保存于4℃冰箱。
113 菌株的液体培养及预处理
将斜面上的菌接种一环于产酶液体培养基中,
30℃,200rΠmin,培养48h;取014mL用水稀释6倍,以空白培养基为对照测量其在620nm处的吸光度(OD
值;剩余菌液离心收集菌体,用0105molΠL磷酸钠缓冲液(pH710510mL洗涤,再离心。
114 完整细胞转化乙酰苯丙氨酸及处理
用0105molΠL磷酸钠缓冲液(pH710配制乙酰苯丙氨酸溶液为6gΠL,调pH为710。
加5mL至湿菌体中,震荡,倒入大试管,30℃,200rΠmin,转化24h,离心取上清液,用茚三酮测定氨基酸的方法测定转化率。
115 完整细胞转化内酰胺
用0105molΠL磷酸钠缓冲液(pH710配制(+Π
-γ内酰胺溶液2gΠL,调pH为710,加5mL至湿菌体中,震荡,倒入大试管,30℃,200rΠmin,转化24h,8000rΠmin离心5min,取上清液用HPLC法测定转化率,用手性HPLC测产率和ee值。
116 HPLC法测定转化率
[4]
色谱柱型号为KromasilC8100A250×416mm;流动相为K3PO40101molΠL(pH710∶甲醇1∶1(VΠV;流速015mLΠmin;检测波长225nm。
水解生成的氨基酸和γ-内酰胺的保留时间分别为513min和712min。
转化率定义为如下:
转化率=
转化生成的氨基酸浓度(molΠL
内酰胺的初始浓度(molΠL
×100%
117 手性HPLC法测定产率和ee值
[7]
色谱柱型号为Daicel公司CHIRALPAKAS-H250×416mm;流动相为乙腈;流速016mLΠmin;检测
波长230nm;内标为乙酰苯丙氨酸。
乙酰苯丙氨酸、
(+γ-内酰胺、(-γ-内酰胺的保留时间分别为1012min、1516min、2013min。
产率和ee值的定义如
下:
产率=产应后(-γ2内酰胺的浓度(molΠL
(+Π-γ2内酰胺的初始浓度(molΠL
×100%
ee=[反应后(-γ2内酰胺的浓度(molΠL-反应后(+γ2内
酰胺的浓度(molΠL]/[反应后(-γ2内酰胺的初始浓度
(molΠL+反应后(+γ2内酰胺的初始浓度(molΠL]×100%
2 结果
211 产内酰胺酶的菌株筛选
21111 富集与分离:
实验室保存的土样(采自宁夏、
西藏等地及从北京部分地区采集的土样共70个,
经选择性平板筛选、划斜面共得到菌株约800余株。
21112 初筛:
按113和114的方法,测定筛选得到的菌株转化乙酰苯丙氨酸溶液的转化率,挑取转化率较高的菌株,筛选得到69株(结果未列出。
275LIHai-quanetal.ΠActaMicrobiologicaSinica(200646(4
21113 复筛:
初筛得到的69株菌转化(+Π-γ-内酰胺溶液,用116的方法测定转化率,其中转化率较高菌株如表1所示。
表1 复筛中转化率的测定
Table1 ThedeterminationofconversionrateinthesecondscreeningStrainNo.ConversionΠ%StrainNo.ConversionΠ%StrainNo.ConversionΠ%N6-722196L5-416151L14-1147111N13-3231125-631116L19-1614122N9-223148L3-314135L7-231142N10-712101L29-960169L17-358148L3-811129L8-1121128L17-143141L3-119167L19-1729196L15-7
22129
L7-8
36182
L23-7
12149
用117的方法测定表1中20株菌拆分内酰胺
获得产物的产率和ee值,结果如表2所示,多数菌株可以得到目的产物(-γ-内酰胺。
表2 产物产率和ee值的测定
Table2 ThedeterminationofyieldandeevalueofresolutionproductStrainNo.YieldΠ%eeΠ%StrainNo.YieldΠ%eeΠ%N13-3401541123L8-112314545121N9-2321635188L23-72112315189L3-83512225136L14-1122191331075-63213174163L7-22813130140L3-3121698154L17-32614231120L29-93512377110L15-7361168145
其中菌株5-6及菌株L29-9的ee值均在70%以上,最终选择L29-9为对象进行下一步的发酵条件的优化。
菌株L29-9菌落呈浅黄色,湿润、粘稠,圆形,边缘整齐,不透明。
革兰氏染色实验显示,L29-9为革兰氏阳性细菌,杆菌,其具体归类有待进一步鉴定。
212 菌株L29-9发酵条件的研究21211 转化时间对转化的影响:
用不同的转化时间
进行内酰胺的转化,测定转化率和ee值,结果显示(图3,菌株L29-9转化内酰胺前10h前较为迅速,12h后其中一种对映体水解完全,之后另一对映体也逐渐减少,故下面的实验转化时间确定为12h。
图3 转化时间对产率和ee值的影响
Fig.3 Effectofconversiontimeonyieldandeevalue.
21212 碳源对产率和ee值的影响:
选择可溶性淀
粉、甘油、糊精、柠檬酸、乳糖、蔗糖,代替产酶培养基
中的葡萄糖,其余成分不变,结果显示(表3,碳源对菌株的生长(OD值显示影响不大,对转化的产率和ee值的影响也不大,相对来说以柠檬酸为碳源时效果较好,因此选择柠檬酸为碳源。
表3 碳源对产率和ee值的影响
Table3 EffectofcarbonsourceonyieldandeevalueCarbonsourceYieldΠ%eeΠ%OD
Dissolvablestarch
261407719301333Glycerol201249617501358Dextrin211079717401330Citricacid321999912601329Lactose201349912001389Sucrose191319816301398Glucose
19198
97135
01386
21213 氮源对产率和ee值的影响:
选择大豆蛋白
胨、牛肉膏、胰蛋白胨、玉米浆、尿素、乙酸铵、硝酸钾,用2gΠL的浓度来替液体产酶培养基中的酵母提
取物和硫酸铵,其余成分不变。
培养两天后,以尿素、乙酸铵、硝酸钾为氮源的培养基中菌体未生长,结果显示(表4,L29-9在有机氮存在的情况下生长良好,但只有无机氮时,基本不生长。
氮源对产率和ee值的影响较大,综合考虑,以酵母提取物为氮源
比较适宜。
表4 氮源对产率和ee值的影响
Table4 EffectofnitrogensourceonyieldandeevalueNitrogensourceYieldΠ%eeΠ%ΠOD
Soyapeptone271048418301359Beefextract301521717801376Tryptone311435915501369Cornsteepliquor23106219401305Yeastextract191989713501392Urea--0Ammoniumacetate--0Potassiumnitrate
--0
21214 柠檬酸浓度对产率和ee值的影响:
用2gΠL
的酵母提取物为氮源,改变培养基中柠檬酸的浓度,培养获得的菌体进行内酰胺的转化,结果显示(图4,培养基中柠檬酸浓度增大反而降低了酶的立体选择性,故柠檬酸浓度以2gΠL为宜。
21215 酵母提取物浓度对产率和ee值的影响:
以2gΠL柠檬酸为氮源,改变培养基中酵母提取物的浓
度,培养获得的菌体进行内酰胺的转化,结果显示(图5,酵母提取物浓度对酶的选择性影响不大,当浓度增大到5gΠL时,酰胺水解酶的活性和选择性都
3
75李海泉等:
产γ-内酰胺水解酶菌株的筛选及发酵条件研究.Π微生物学报(200646(4
比较好,再增大时立体选择性稍有降低,故选择酵母
提取物5gΠL为氮源
。
图4 柠檬酸浓度对产率和ee值的影响
Fig.4 Effectofcitricacidconcentrationonyieldandee
value.
图5 酵母提取物浓度对产率和ee值的影响
Fig.5 Effectofyeastextractconcentrationonyieldandeevalue.
21216 初始pH值对产率和ee值的影响:
改变培养
基的初始pH值,测定对产率和ee值的影响,当初始pH值为510和910时,L29-9未生长,培养获得的菌体进行内酰胺的转化,结果显示(表5,pH值为710时,菌株L29-9具有最高的产率和ee值。
表5 初始pH对产率和ee值的影响
Table5 EffectofinitialpHonyieldandeevalueInitialpHYieldΠ%eeΠ%OD
510--061022125131
9501311710281739216001376810151808611801352910
--0
21217 菌株L29-9培养时间对产率和ee值的影响:
改变L29-9的培养时间,培养获得的菌体进行内酰胺的转化,结果显示(图6,在菌株L29-9生长的稳定期,菌体对内酰胺的转化都有较好的产率和较高的立体选择性,当培养时间为40h时,产率和ee值分别为40%和9915%。
21218 菌株L29-9培养温度对产率和ee值的影响:
在上述确定的条件下,选择发酵温度为25℃,30℃,
35℃,37℃,40℃,45℃,发现在37℃以上菌株L29-9图6 培养时间对产率和ee值的影响
Fig.6 Effectoffermentationtimeonyieldandeevalue.
几乎不生长。
结果显示(图7,L29-9不耐受较高温
度,考虑产率和ee值,温度仍然选择30℃。
图7 培养温度对产率和ee值的影响
Fig.7 Effectoffermentationtemperatureonyieldandeevalue.
3 讨论
由于本研究中采用的底物γ-内酰胺比较昂贵,
所以本研究采用两步筛选的方法,在筛选过程中发现很多菌株可以在选择性平板上生长,但是用茚三酮方法却测定不出酶活,很可能由于N-乙酰苯丙氨酸水解后产生的苯丙氨酸迅速进入后续代谢过程,而使菌株表现不出活力。
通过第一轮筛选获得了69株菌,对这些菌株转化γ-内酰胺的能力进行了测定,得到了20株具有γ-内酰胺水解酶活力的菌株,可见能水解N-乙酰苯丙氨酸的菌株对γ-内酰胺也未必能起到作用,而在前期的筛选过程中也可能丢掉了能产γ-内酰胺酶的菌株。
经过手性色谱分析,在这20株菌中,菌株L29-9具有最高酶活力和立体选择性。
通过培养条
件的优化,提高其γ-内酰胺水解酶的活力和对映体
选择性,结果表明,选择碳源柠檬酸2gΠL、氮源酵母提取物5gΠL、pH710、培养时间40h时,通过完整细胞转化,在30℃下经过12h的反应,可以得到ee值为9915%的目标产物(-γ-内酰胺,产率40%。
L29-9菌株产生作用的酶的具体类型及作用机理尚
不清楚,这也正是下一步研究的重点。
475LIHai-quanetal.ΠActaMicrobiologicaSinica(200646(4
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LIHai-quan1,SULei1,YANGLiu2,WANGJian-jun23,ZHENGGuo-jun13
(1DepartmentofPharmaceuticalEngineering,BeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China
(2StateKeyLaboratoryofMicrobiologyResourcesInstituteofMicrobiology,C
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