腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染促进人间充质干细胞成骨化的.docx

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华中科技大学硕士学位论文腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染促进人间充质干

细胞成骨化的研究姓名:

孙志波申请学位级别:

硕士专业:

外科学（骨外）指

导教师:

杨述华禹志宏20090401华中科技大学硕士学位论文腺病毒介

导骨形态发生蛋白2基因转染促进人间充质干细胞成骨化的研究华中科技大学

同济医学院附属协和医院骨科学生姓名:

孙志波导师姓名:

杨述华教授禹志宏

教授中文摘要目的观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因转染对人

间充质干细胞（hMSCs）成骨能力的影响。

方法从健康志愿者全骨髓中分离培养

hMSCs，体外扩增纯化后随机分为4组。

?

Ad-BMP-2组:

培养液中加入BMP-2基

因重组腺病毒（Ad-BMP-2，1×1010OPU/ml）孵育24h，之后换普通培养液继续培

养。

?

Ad-LacZ组:

用半乳糖酐酶基因重组腺病毒（Ad-LacZ）替换Ad-BMP-2，

其余处理与Ad-BMP-2组相同。

?

阳性对照组:

培养液中添加地塞米松、抗坏血

酸和β-甘油磷酸钠。

?

空白对照组:

不给予特殊处理。

各组细胞处理后2w，VonKossa

染色检测hMSCs中骨胶原结节形成;全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶

（ALP）活性。

结果经多次换液传代，hMSCs呈均一梭形形态。

处理后Ad-BMP-2

组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少。

VonAd-LacZ组和空白对照

组形态无明显变化。

Kossa染色Ad-BMP-2组与阳性对照组可见大量红色骨胶原

结节形成，显著多于Ad-LacZ组和空白对照组。

培养上清ALP活性检测Ad-

BMP-2组与阳性对照同样显著高于Ad-LacZ组和空白对照组。

结论Ad-BMP-2基

因转染对hMSCs成骨能力具有促进作用。

关键词间充质干细胞;骨形态发生蛋

白;腺病毒;基因转染;骨生成1华中科技大学硕士学位论文

Adenovirusmediatedbonemorphogeneticprotein2genetransfectionpromoteshumanmesenchymalstemcellsosteogenesisDepartmentofOrthopedicsUnionHospitalTongjiMedicalCollegeHuazhongUniversityofScienceandTechnologyPostgraduate:

SunZhi-boTutor:

YangShu-huaProfessorYuZhi-hongProfessorAbstractObjectiveToinvestigatetheosteogenesiseffectofadenovirusmediatedbonemorphogeneticprotein2Ad-BMP-2genetictransfectiononhumanmesenchymalstemcellshMSCs.MethodshMSCswereisolatedfromhealthvolunteersculturedandpurifiedinvitroandrandomlydividedinto4groups.InAd-BMP-2groupBMP-2recombinantadenovirusAd-BMP-2wasaddedintoculturemedium1×1010OPU/mlandincubatedfor24h.InAd-LacZgroupAd-BMP-2wasreplacedbyLacZrecombinantadenovirusAd-LacZothersweresameasAd-BMP-2group.Inpositivecontrolgroupdexamethasone1nmol/Lglycerophosphate10mmol/Landascorbic50mg/Lwereaddedintoculturemediumfor2w.Inblankcontrolgroupnospecialtreatmentwasadministrated.TwoweeksaftertreatmentcalcifiednodesofhMSCsineachgroupweretestedbyVonKossastainingandalkalinephosphataseALPofculturemediumineachgroupwasdetected.ResulthMSCswereuniformspindle-shapefibroblastafterseveralpassages.AftertreatmenthMSCsinAd-BMP-2groupandinpositivecontrolgroupgraduallyshowedflatshapebutdidnotInAd-LacZandblankcontrolgroup.VonKossastainingdemonstratedthatredbonecollagennotesofhMSCsinAd-BMP-2groupandpositivecontrolgroupweresignificantlymorethaninAd-LacZandblankcontrolgroup.SimilarlyALPof2华中科技大学硕士学

位论文culturemediuminAd-BMP-2groupandinpositivecontrolgroupweresignificantlyhigherthaninAd-LacZgroupandblankcontrolgroup.ConclusionAdenovirusmediatedBMP-2genecantransfecthMSCsandpromoteosteogenesisof

hMSCs（KeywordsMesenchymalstemcellsbonemorphogeneticprotein2Adenovirus

GenetransfectionOsteogenesis3华中科技大学硕士学位论文英文缩写词表hMSCshumanmesenchymalstemcells人间充质干细胞BMPbonemorphogenetic

proteins骨形态发生蛋白BDGFbone-derivedgrowthfactor骨源性生长因子VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子TGF-βtransforminggrowthfactorβ转化生长因子βGFgrowthfactor生长因子SGFskeletalgrowthfactor骨骼生长因子IGFinsulin-likegrowthfactor胰岛素样生长因子aFGFacidfibroblastgrowth

factor酸性成纤维细胞生长因子bFGFbasicfibroblastgrowthfactor碱性成纤维细胞生长因子PDGFplatelet-derivedgrowthfactor血小板源性生长因子ALPalkalinephosphatase碱性磷酸酶MEMminimalessentialmedium必须培养基CBBceramicbovinebone煅烧骨HAhydroxyapatit羟基磷灰石4独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。

尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。

学位论文作者签名:

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年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即:

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保密?

，在_____年解密后适用本授权书。

本论文属于不保密?

。

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”）学位论文作者签名:

指导教师签名:

日期:

年月日日期:

年月华中科技大学硕士学位论文1.绪言骨折后至少6个月没有愈合，并且没有进一步愈合倾向已有3个月，称之骨不连，骨不连的原因是多方面的，且极为复杂，但总的来说有三方面，即生物学因素、局部因素及技术因素，其中技术因素比其他两种因素引起骨不连的发生率高。

骨不连的治疗是临床的难题，包括非手术治疗和手术治疗，非手术治疗在骨折延迟愈合骨不连的治疗中有重要地位。

促进骨折愈合的方法有骨移植、骨移植替代物、电刺激及超声波刺激和生物化学物质，促进骨折愈合的物质主要有以下几种。

骨形态发生蛋白Senn1889就报道脱钙骨在临床应用充填骨死腔。

由于骨基质脱钙方法在不同的研究中有所差异，至手术效果难以阐明和对比。

20世纪60年代，Urist等认为这种脱钙骨中含有一种诱导因子，在时间、湿度、酸性环境的控制下，有持续的骨诱导作用，并认为是一种糖蛋白，并将其命名为骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticproteins，BMP），骨形态发生蛋白能诱发组织修复，使周围未分化的间叶细胞增殖，进而形成软骨母细胞和骨母细胞，因而可促进骨愈合。

可从兔、羊、猪、牛、鼠的正常骨组织中提取，在人和鼠的成骨细胞瘤中含量也较少，已能从人骨中部分的提纯。

人和牛的BMP分子量18000，具有酸性蛋白的特性，由于人的骨基质不易得到，多从牛骨中提取，认为抗原性较小。

在实验和临床证实中能促进骨愈合。

因而BMP是很有前途的加速骨形成的一种物质，目前，它已能提炼出可溶性和非可溶性两种类型，即将作为商品促进新骨形成。

骨源性生长因子培养的骨细胞能释放出一种调节骨生长的因子称为骨源性生长因子（bone-derivedgrowthfactor，BDGF），这种生长因子在鼠的颅骨培养基中发现，它对骨没有特异

性，不但刺激骨细胞增殖和胶原合成，而且刺激软骨的合成，增加软骨细胞的复制。

骨生长因子、软骨源性生长因子、血小板源性生长因子及生长转移因子等也是促进骨折愈合的重要因子，骨生长因子和软骨源性生长因子分子量相似，前者是通过刺激甲状旁腺分泌，因而在骨形成和吸收中起连接作用。

血小板源性生长因子能促进间叶细胞生长和正常细胞的增殖和分化。

5华中科技大学硕士学位论文干细胞是目前生命科学的研究热点，人间充质干细胞（humanmesenchymalstemcellshMSCs）是一类主要存在于骨髓的中胚层来源的成体干细胞1，具有很强的成骨分化能力2，因其自身所具有的特殊性而日益受到人们的关注。

在特定的条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种中胚叶来源的组织细胞，而且hMSCs特性稳定，易于获得及扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能3在组织工程中具有良好的应用前景，为骨缺损等难治性骨疾病治疗带来希望4。

此外，hMSCs还是基因治疗的良好载体，很容易携带外源目的基因5。

人间充质干细胞向成骨细胞分化过程中受各种细胞生长因子的影响，主要有骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF-β）、骨骼生长因子（SGF）或胰岛素样生长因子IGF、酸性或碱性成纤维细胞生长因子（aFGF、bFGF）、血小板原性生长因子（PDGF）及肿瘤坏死因子等来源于造血细胞系的一些因子。

具有提高骨愈合能力的各种因子已被研究，在众多骨生长因子中，骨形态发生蛋白是其中最重要的一种，它已被公认为是目前最强的骨诱导因子。

骨形发生蛋白2是目前国内外研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白家族成员之一，可诱导多能干细胞分化成为成骨或成软骨细胞，大量实验证实将BMP-2直接或通过载体局部应用促进骨形成6，将整合有BMP-2基因的腺病毒载体体外转染骨髓基质细胞后植入体内可治疗骨缺损7，通过细菌内同源重组技术成功构建BMP-2基因重组复制缺陷性腺病毒（Ad-BMP-2），可高效感染hMSCs，使之大量表达有利于骨组织修复。

然而Ad-BMP-2是否对hMSCs的成骨能力产生影响，目前报道较少。

本研究通过观察腺病毒介导BMP-2基因转染后hMSCs成骨能力的变化，以验证转染BMP-2的hMSCs移植治疗骨疾病的可行性。

6华中科技大学硕士学位论文2.理论分析骨缺损在临床上一直是一个难题。

为治疗骨缺损，有效的骨形成是最根本和最有效的办法，骨形成主要与以下5个因素相关8?

直接参与骨形成的细胞;?

细胞基质;?

通过血管化带来的营养物质;?

细胞活动及钙化过程中的调控剂;?

生物力学机制。

对于修复局部骨缺损，这5个因素运用的越多越有利于骨缺损的修复。

骨折的愈合和骨的改建过程中，传统治疗以自体骨移植为最优，但是自体骨来源有限，并且会对供体造成新的缺损。

异体骨有免疫原性，而且有潜在传染病原体的危险。

金属类、合成塑料类、陶瓷类以及硅橡胶等人工材料缺乏骨诱导性。

近来，由支架材料、种子细胞和生长因子复合构建的组织工程骨，可通过骨引导和骨诱导方式共同完成骨修复和重建，为骨缺损的治疗带来希望。

2.1种子细胞骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcellsMSCs）是存在于骨髓中并具有多项分化潜能的一类干细胞，近年来人们成功地从人和动物体内分离出MSCs并发现其在体外仍能保持干细胞的特性，并在一定条件下分化成骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪等多种间充质组织，和神经系统的神经元和神经胶质细胞。

因其来源容易、体外易于扩增、外源基因容易导入等特点，MSCs作为骨、软骨创伤缺损和退变修复的种子细胞已经越来越受

关注。

基于MSCs体外易于培养、扩增以及成骨、软骨性定向分化的特点，研究者相继试探用该细胞修复受损的骨、软骨组织体内研究。

在体外培养MSCs并向骨、软骨诱导分化，然后尽可能快的将足够多的细胞输送到创伤部位，迅速形成相当大、小的间充质胚基使得骨再生而实现创伤修复。

然而，MSCs虽然可以分化为骨、软骨细胞，但需要细胞因子的持续刺激，而成体内这些细胞因子缺乏，如果将细胞植入骨缺损部位，细胞可能还未分化就已经凋亡。

研究者们就设想能否用一些刺激细胞分化的因子基因去修饰MSCs，使得MSCs分化、增殖并不断分泌基质而达到治疗骨、软骨缺损的目的。

基因治疗主要包括目的基因的选择和靶细胞的选择，基因导入的方法和载体的选择。

目前，人们所采用的基因主要为可以使MSCs分化、增殖、分泌基质的一些特定7华中科技大学硕士学位论文蛋白基因，如:

胰岛素样生长因子-1（IGF21）、TGF-B、软骨源形成蛋白（CDMP）、BMPs等。

目前，在骨、软骨缺损修复中可供基因导入的载体分两大类:

病毒载体和非病毒载体。

MSCs是理想的基因治疗的靶细胞，具有基因导入容易、经过多次分裂仍表达外源蛋白的特点9。

现在的基因治疗研究还停留在单一因子对骨、软骨修复，并且一种细胞蜃蛹瓤梢杂盏糓SCs分化为骨，也可以诱导其分化为软骨，修复哪方面的缺损，可能与MSCs所处的微环境有关。

目前对骨髓干细胞的研究取得了很大进展，但是仍有一些问题摆在人们面前:

?

到目前为止还没有十分完善的分离纯化细胞的方案，大多数实验室仍是根据细胞贴壁的性质分离细胞，但是分离的细胞纯度和功能不能令人满意。

?

尚未建立鉴定MSCs的统一标准，目前还未能筛选到MSCs特异性的标记分子。

?

骨髓MSCs具有多向分化潜能，但是分化效率不高，体外分化是否会引起遗传性质的改变还需要进一步证实。

?

骨髓干细胞诱导分化的信号转导机制还不是特别的明确，还需要进一步探索。

?

合适的基质材料是骨、软骨组织工程的关键，到目前为止，还没有找到理想的基质材料，当务之急仍是对理想材料的探索。

2.2生长因子骨生长因子或细胞生长因子是由骨细胞产生，分泌到骨质中的一些多肽。

骨受损后破骨细胞进行骨吸收，这些因子以活性方式释放，参与骨形成的调控过程。

目前，从骨基质、骨器官和骨细胞条件培养基中分离出的骨生长因子主要有以下几类:

骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF-β）、骨骼生长因子（SGF）或胰岛素样生长因子IGF、酸性或碱性成纤维细胞生长因子（aFGF、bFGF）、血小板原性生长因子（PDGF），还有肿瘤坏事因子等来源于造血细胞系的一些因子。

具有提高骨愈合能力的各种因子已被研究，在众多骨生长因子中，骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticproteins，BMP）是其中最重要的一种，它已被公认为是目前最强的骨诱导因子10，也是最有前途的，包括BMP2，BMP4和BMP7，BMP已被应有到各种动物模型当中诱导骨形成修复骨缺损11-14。

应用BMP促进骨缺损修复的动物实验研究，已有大量的文献报道。

目前国内外已开始将BMP应用于临床。

骨形态发8华中科技大学硕士学位论文生蛋白属于TGF-β超家族，BMP是一组分泌性的蛋白质，除BMP-1外均属于TGF-β（转化生长因子-β）超家族成员15，16。

在体内可以通过旁分泌和自分泌的形式诱导骨的形成17，18，BMP还参与了其他组织和器官的形成，包括软骨肌腱韧带及肾等19，BMP最主要的特征是在体内诱导异位和原位新骨、软骨及与骨组织有关结缔组织如肌腱及韧带的形成，Urist发现脱矿骨基质植于皮下或肌组织内可诱导骨组织形成，这一现象成为发现BMP家族的起点，其中BMP-2、4、5、6、7等与骨、

软骨、肌腱、牙周组织、牙本质的形成有极为密切的关系，均起诱导骨形成的作用，现已将局部直接给予骨形态发生蛋白疗法大量应用于动物模型并成功地使骨不连、骨缺损部位以新骨重新连接。

但是，BMP通常以二聚体的形式存在，作用的靶细胞是局部具有多向分化能力的母细胞。

骨母细胞向矿化细胞的转化，是骨再生中的关键步骤。

BMP是这一转化过程的重要调节因子，在高于一定浓度时，可启动骨形成的一系列步骤，与其特异的受体结合，引起细胞内的信号转导，启动细胞的矿化系统20。

BMP诱导骨形成已被证实，但这个过程好像有几个不同的途径共同起作用，其中一个是血管生成途径，抑制血管生成可阻止由BMP2诱导的异位骨化21。

血管与骨的新生是一个病程逆转的关键，骨的新生离不开血管的新生。

已知的与血管新生有关的生长因子有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β1、血管内皮生长因子（VEGF），其中VEGF是最有力的血管生成因子，VEGF特异作用于内皮细胞，进其增殖和血管生成，在骨生成过程中凭借软骨内钙化途径起着中重要作用，拮抗VEGF则抑制血管生长、软骨吸收减弱，继之可导致在骨生长板骨小梁形成减少22。

VEGF由Ferrara等学者在1989年从牛的垂体星形滤泡细胞（FC）条件培养基中分离提取出来的的，又名血管渗透因子，滤泡星形细胞衍生的生长因子，神经胶质瘤衍生的血管内皮细胞促分裂源和血管调理素等。

它是一种具有与肝素结合活性的生长因子，特异的作用于血管内皮细胞，诱导体内的血管生成，这一特征使VEGF有别于以前所发现和纯化的血管形成蛋白:

?

VEGF是一种分泌性的，（并通过与细胞受体Flk-1KDR）Flt-1相互作用，直接作用于内皮细胞;?

VEGF是由内皮细胞临近的细胞产生，这表明了血管形成的一种旁分泌机制;?

VEGF的表达是受缺氧高度调节的，这样便提供了一种生理反馈机制，即通过促进血管的形成，调节不充足的组织氧合作用;?

VEGF9华中科技大学硕士学位论文是一种作用很强的生长因子，它的过度表达或表达不足能在很大程度上影响体内血管的形成。

由于mRNA拼接方式的不同，目前人们共发现了5种分子量大小不同的VEGF即分子，VEGF121，VEGF165，VEGF189，VEGF206。

除了VEGF121之外，其它几种VEGF分子都具有与肝素结合的活性。

其中VEGF165在体内的含量最高，而且活性也最强。

VEGF是血管内皮细胞特异的有丝分裂原，能诱导体内血管的新生，而且还是单核细胞的趋化因子。

同时，VEGF具有增加血管通透性的功能。

VEGF表达于胚胎形成过程中的血管发育过程，以及出生后的心脏缺血，粥样动脉硬化，糖尿病性视网膜病变，肿瘤形成，关节炎和伤口愈合过程。

目前人们已经考虑到了VEGF基因的治疗作用:

促进缺血侧枝和心脏中的血液流动，通过促进再次内皮细胞化，减少动脉损伤后血管的狭窄，促进皮肤损伤的愈合。

骨形成过程中VEGF可能是通过和调控骨生成平衡的体液因子相互作用而发挥作用23。

因此探讨VEGF和BMP在骨形成过程中的作用，可以发现一个新的方法去提高骨愈合，修复骨缺损。

传统的BMP和VEGF蛋白制备，无论是从骨基质中提纯，还是用基因工程表达，程序复杂，产量低，活性不稳定;有效安全的局部剂量很难达到:

在修复大动物的骨缺损时，BMP和VEGF的用量大，可能会产生毒性反应;BMP和VEGF作为外源性蛋白植入体内，也可能引起免疫反应24。

最近，有报道致力于采用缓释技术来解决这个缺陷，但是仍需克服在支架材料中.