ELISA试剂配制及实验流程BDY.docx
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ELISA试剂配制及实验流程BDY
ELISA试剂配制及实验流程
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定((Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。
以双抗体夹心法举例说明。
试剂配制:
(1) 包被缓冲液+碳酸盐缓冲液):
Na2CO3
NaHCO3
加蒸馏水至1000ml。
(用时稀释成1x,加%BSA)
(2) 洗涤缓冲液0.15MPBST):
%Tween-20
加在PBS缓冲液1000ml中。
PBS缓冲液:
KH2PO4 0.27g
Na2HPO4·12H2O 3.58g
NaCl 8g
KCl
加蒸馏水至1000ml。
(3) 封闭缓冲液:
牛血清白蛋白(BSA)2%2g
(或5%脱脂奶粉)加洗涤缓冲液100ml。
(4) 稀释液:
牛血清白蛋白%
加PBS缓冲液100ml。
(5) 底物缓冲液:
Na2HPO4(无水L,带12结晶水L)取
柠檬酸(无水L,带1结晶水L)取
加蒸馏水至100ml。
(或Na2HPO4·12H2O1.84g
柠檬酸·H2O0.51g
加蒸馏水至100ml)
(6) TMB(四甲基联苯胺)显色液(显蓝色):
HRP-
TMB(2mg/ml水)
底物缓冲液
30%H2O2
总体积1ml。
TMB,1mg/ml-DMSO溶解
(7)或配OPD(邻苯二胺)显色液(显黄棕色)(现配避光):
OPD(干粉)0.004g
底物缓冲液10ml
30%H2O2
总体积10ml。
(8) 终止液(2M H2SO4):
在水中,逐滴加入浓硫酸(18M,约98%),边加边摇。
操作步骤:
1. 包被:
用包被液将抗体(一抗)稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。
在每板的反应孔中加,4℃过夜(或37℃温育2~3小时)。
次日,弃去孔内溶液,用洗涤液冲洗3次,中间振荡。
(简称洗涤,下同)。
2.封闭:
加封闭液于上述已包被之反应孔中,置37℃温育2小时。
然后洗涤。
3. 加样:
加待检样品于反应孔中,置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔(不加样品),阴性对照孔(野生型)及阳性对照孔)。
4.加一抗:
各反应孔中加入新稀释的抗体。
置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
5. 加酶标二抗:
各反应孔中加入新稀释的酶标抗体。
37℃温育45分钟~1小时,洗涤5次。
6. 加底物液显色:
各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液(或OPD显色液),37℃暗处温育5~20分钟,或室温暗处10~40分钟充分变色。
7. 终止反应:
各反应孔中加入2M硫酸。
(TMB底物蓝色变黄色,OPD底物黄色变棕色)
8. 结果判定:
白色背景上肉眼直接观察结果,反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,可以依据所呈颜色的深浅,用“+”、“-”号表示。
测OD值:
在ELISA检测仪上,TMB底物法使用450nm测各孔OD值,OPD底物法使用492nm检测。
通常大于规定的阴性对照OD值的倍,即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。
间接法操作步骤:
1. 包被:
用包被液将样品稀释(梯度稀释,比例自己定),4℃过夜(或37℃温育2~3小时)。
次日,弃去孔内溶液,用洗涤液冲洗3次(5至7次),中间振荡。
(简称洗涤,下同)。
2.封闭:
加封闭液于上述已包被之反应孔中,置37℃温育2小时。
然后洗涤。
3.加一抗:
各反应孔中加入新稀释的抗体。
置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
4. 加酶标二抗:
各反应孔中加入新稀释的酶标抗体。
37℃温育45分钟~1小时,洗涤5次。
5. 加底物液显色:
各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液(或OPD显色液),37℃暗处温育5~20分钟,或室温暗处10~40分钟充分变色。
6. 终止反应:
各反应孔中加入2M硫酸。
(TMB底物蓝色变黄色,OPD底物黄色变棕色)
7. 结果判定:
白色背景上肉眼直接观察结果,反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,可以依据所呈颜色的深浅,用“+”、“-”号表示。
测OD值:
在ELISA检测仪上,TMB底物法使用450nm测各孔OD值,OPD底物法使用492nm检测。
通常大于规定的阴性对照OD值的倍,即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。
------罗凯明师兄----------
包被缓冲液(NaHCO3-Na2CO3缓冲液)量取0.2M?
NaHCO3?
17mL,0.2M?
Na2CO3?
8?
mL溶于75mL双蒸水中
PBS称取NaCl?
8.0g,?
Na2HPO4?
12H2O?
2.9g,KCl?
2.0g,KH2PO4?
0.2g溶于1000?
mL双蒸水中
洗涤液(PBST?
)量取?
Tween-20溶于1000?
mL?
PBS中
酶标抗体稀释液量取4mL新生小牛血清CS溶于96mL?
PBST中
底物液?
?
?
称取OPD?
4mg溶于40?
mL?
3%H2O2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中,临用前配制
磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液量取?
mL?
0.1M柠檬酸钠,?
mL?
0.2M?
Na2HPO4,加双蒸水至100?
mL
明胶封闭液称取1g明胶溶于100?
mL?
PBS中
小牛血清封闭液量取10mL小牛血清溶于90mL?
PBS中
酶反应终止液(2M?
H2SO4)量取10mL浓H2SO4溶于80mL双蒸水中
ELISA步骤:
----------根哥给的方法-----------
1)实验材料
目的抗原
BSA或其他对照抗原(15uμg/ml)
PBS
96孔ELISA板;
96孔ELISA封板膜;
移液枪
封闭液:
5%脱脂牛奶(w/v)-PBS
抗血清
%(v/v)Tween20-PBS
HRP-兔抗鼠多克隆抗体
TMB(A,TMB:
称取固体TMB溶于DMSO配成1mg/ml液体,避光保存,最好4度用前要检查其状态,若有凝固,可用手温将其融化;B,底物缓冲液为0.1M醋酸钠-醋酸缓冲液,;使用时用底物缓冲液稀释A液至100μg/ml;50ml缓冲液加入10μl30%H2O2)。
稀硫酸(1M)
酶标仪
2)实验步骤
(1).用PBS缓冲液将抗原(目的抗原、BSA或其他对照抗原)稀释至μg/ml。
。
(2).每孔加入100μl抗原稀释液,4℃包被过夜。
(3).以用PBS洗3次(每次每孔200μl,每次洗5min)。
每孔加入200μl封闭液,37℃封闭2h。
(4).弃封闭液,以%Tween20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl,每次洗5min),然后用PBS洗3次(每次每孔200μl,每次洗5min)。
每孔加入100μl已稀释好的抗血清,37℃孵育2h。
(5).以%Tween20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl,每次洗5min),然后用PBS洗3次(每次每孔200μl,每次洗5min)。
6.弃洗涤液,每孔加入100μl按说明书比例稀释的HRP-兔抗鼠多克隆抗体,37℃孵育h。
7.以%Tween20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl,每次洗5min),然后用PBS洗3次(每次每孔200μl,每次洗5min)。
8.弃洗涤液,每孔加入100μl底物液,室温孵育10min(视情况而定)。
孔内的液体将显示为蓝色。
9.每孔加入50μl稀硫酸(1M)终止反应。
10.测定OD450和OD650,并以OD450的值减去OD650的值,作为最后的检测结果。
ELISA。
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