免疫亲和光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉精.docx
- 文档编号:27292126
- 上传时间:2023-06-28
- 格式:DOCX
- 页数:9
- 大小:26.17KB
免疫亲和光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉精.docx
《免疫亲和光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉精.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《免疫亲和光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉精.docx(9页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
免疫亲和光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉精
中国饲料2007年第24
期
黄曲霉毒素由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生,主要包括B1、B2、G1和G24种毒素,其中B1是毒性和危害最大的一种,B2和G2分别是B1和G1的双羟基衍生物。
黄曲霉毒素是一级致癌物质,其毒性比氰化钾要强10倍,能使植物和动物细胞染色体发生畸变,使胎儿发生畸形。
花生粕的营养价值较高,适口性好,是猪、鸡等单胃动物及反刍动物的良好饲料。
但是其易感染黄曲霉菌而产生黄曲霉毒素,所以要加强花生粕原料和以花生粕为原料的混合饲料中黄曲霉毒素的检测和控制。
目前国际上黄曲霉毒素测定普遍采用荧光光度计法,但该法只能测定总黄曲霉毒素(GB/T18979-2003。
黄曲霉毒素主要的衍生方法有柱前三氟乙酸衍生,柱后碘衍生、电化学在线柱后衍生,溴化吡啶溴衍生法(Stroka等,2003;宋欢,2001。
衍生后通过高效液相色谱-荧光法测定黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。
Waltking和Wilson(2006采用柱后光化学衍生法测定了坚果中的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。
本研究采用了免疫亲和柱净化,柱后光化学衍生,高效液相色谱法结合荧光检测器测定花生粕中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。
1材料与方法
1.1仪器与试剂L2130型高效液相色谱仪;荧光检测器;AURAINDUSTRIES光化学衍生器;高速均质器;免疫亲和柱分离6位泵流操作架;Afla-P黄曲霉毒素免疫亲和柱;1.5μm玻璃纤维滤纸。
黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2混合标准溶液(美国SUPLCO公司;甲醇(色谱纯。
黄曲霉毒素标准储备液的配制:
将黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2混合标准溶液1mL全部转移到10mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。
0.1%吐温-20/PBS清洗液的配制:
称取8.0gNaCl,1.2gNa2HPO4,0.2gKH2PO4,0.2gKCl,用
免疫亲和-光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定花生粕中黄曲霉毒素的研究
中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所陈新
北京中检维康技术有限公司王雄雷达
[摘要]研究建立了光化学柱后衍生-高效液相色谱(HPLC-荧光检测器测定花生粕中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的方法。
甲醇/水提取样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2,Afla-P黄曲霉毒素免疫亲和柱净化,经高效液相色谱分离后,由光化学柱后衍生,通过荧光检测器测定。
结果表明:
在优化条件下,黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的检出限分别为1.0、0.3、1.0μg/kg和0.3μg/kg,回收率为67.0%~117%,相对标准偏差(RSD低于18.2%。
该方法简便快速、灵敏度高、重现性好,满足饲料用花生粕中黄曲霉毒素检测的需要。
[关键词]免疫亲和柱;光化学衍生;高效液相色谱;黄曲霉毒素;花生粕
[中图分类号]S816.17[文献标识码]A[文章编号]1004-3314(200724-0030-03[Abstract]AmethodfordeterminationofAflatoxinB1,B2,G1andG2byusingphotochemicalderivatization-HPLC-fluorescencedetectorwasdeveloped.TheAflatoxinB1,B2,G1andG2insampleswereextractedbymethanol/waterandwerecleanedupbyimmunoaffinitycolumns.TheseparationofAflatoxinB1,B2,G1andG2wasconductedbyHPLC,thedeterminationwascarriedoutbyfluorescencedetectorafterphotochemicalderivatization.Underoptimumconditions,thelimitsofdeterminationofAflatoxinB1,B2,G1andG2were1.0,0.3,1.0μg/kgand0.3μg/kgrespectively,therecoveriesofanalyteswerefrom67.0%to117%andtherelativestandarddeviationswerebelow18.2%.Themethodissimple,highsensitiveandgoodrepeatability,whichissuitableforthedeterminationofAflatoxininpeanutresidues.
[Keywords]immunoaffinitycolumn;photochemicalderivatization;HPLC;Aflatoxin;peanutresidues
30
中国饲料
2007年第24期(下转第34页
黄曲霉毒素
线性方程
相关系数
线性范围(ng/mL
检出限(ng/mL
B1y=151354x-1137270.99390~501.0B2y=282044x-761520.99340~150.3G1y=67639x-597540.99410~501.0G2
y=136211x-41386
0.9921
0~15
0.3
990mL纯水将上述试剂溶解,加入1mL的吐温-20,然后用浓HCl调pH至7.0,最后用纯水稀释
至1000mL。
1.2
色谱条件高效液相色谱用分析柱是
CloversilODS-C18柱,粒径5μm,内径4.6mm,柱长150mm。
甲醇∶水(50∶50,V∶V为流动相;流动相流速为1mL/min;进样量为20μL;柱温为25℃;检测器为荧光检测器,检测激发波长为360nm,发射波长为440nm。
1.3实验方法
1.3.1样品制备。
花生粕样品为均匀颗粒状,粒径为2~3mm。
在进行黄曲霉毒素添加回收率实验,需将25g空白样品中添加适量的黄曲霉毒素混合标准溶液,放置4h以上或过夜。
1.3.2提取。
称取25g样品于高速均质器中,加5g的氯化钠,加入100mL甲醇+水(80∶20,V∶V,
以均质器高速提取1~2min,用中速滤纸过滤,收集滤液10mL,用40mL纯水稀释。
1.3.3净化。
将上述稀释后的滤液以玻璃纤维滤
纸过滤,移取滤液20mL(相当于1.0g样品过
Afla-P黄曲霉毒素免疫亲和柱,调节流速1~2
滴/s,直至空气完全通过免疫亲和柱。
用10mL
0.1%吐温-20/PBS清洗液以2~3滴/s清洗免疫
亲和柱。
然后用10mL的纯水以2~3滴/s清洗
免疫亲和柱两次,直至空气完全通过免疫亲和柱。
加入1mL甲醇,调节流速1~2滴/s的流速将免疫亲和柱中的黄曲霉毒素淋洗下来。
1.3.4测定。
从上述淋洗下来的1mL洗脱液中
准确移取200μL,加200μL纯水混匀,然后取
20μL注入高效液相色谱仪中,用峰面积计算,外
标法定量。
2结果与分析
2.1光化学衍生
本实验采用的光化学衍生池
利用紫外光照射,使流动相光解出具有荧光特性的基团,与黄曲霉毒素B1、G1分子上的活性双键发生羟基化反应,生成荧光特性更强、更稳定的物质,解决了黄曲霉毒素B1、G1在水溶液中有荧光淬灭的现象。
由图1和图2可知,在未进行光化学衍生化时,因流动相中水对黄曲霉毒素B1和
G1具有强烈的荧光淬灭作用,荧光强度大幅度减
小,信号响应低。
通过光化学衍生后时,黄曲霉毒素B1和G1荧光强度增强。
2.2方法性能按1.2的色谱条件进行测定,以
各黄曲霉毒素峰面积(y为纵坐标,黄曲霉毒素浓度(x,ng/mL为横坐标进行线性回归,结果见表
1。
由表1可知,在0~50ng/mL,黄曲霉毒素B1和G1具有良好的线性关系。
在0~15ng/mL范围
内,黄曲霉毒素B2和G2具有良好的线性关系。
2.3回收率和精密度测定用不含黄曲霉毒素
B1、B2、G1和G2的花生粕作为空白样品进行添加
回收和精密度实验,样品中添加不同浓度标准、搅拌均匀后静置4h以上,以保证黄曲霉毒素被样品充分的吸收,然后按照本方法进行处理,结果见表2。
从表2可知,该方法准确度好,黄曲霉毒素
B1、B2、G1和G2回收率为67%~117%;精密度
高,其RSD低于18%。
2.4样品测定将该方法用于随机抽样获得的25个花生粕样品测定,均有检出。
大部分黄曲霉
毒素总量分布在2~50ng/g之间。
只有1个样品黄曲霉毒素总量为147ng/g,其中黄曲霉毒素B1
图2衍生后的黄曲霉毒素标准溶液色谱图
图1
未衍生的黄曲霉毒素标准溶液色谱图
50.0
35.0
20.0
5.0-10.0
0.0
3.3
6.7
10.0
13.3
16.7
20.0
6.44G2
9.18B2
10.95B1
50.0
35.0
20.0
5.0-10.0
0.0
3.3
6.710.0
13.3
16.720.0
6.41G2
9.15
B2
10.90
B1
7.44G1
表1
方法的性能
响应强度
时间(min
响应强度
时间(min
31
中国饲料2007年第24期
(上接第31页
为121ng/g,黄曲霉毒素B2为20ng/g,黄曲霉毒素G1为4ng/g,黄曲霉毒素G2为2ng/g。
说明花生粕中黄曲霉毒素污染比较严重,必须对这类原料与产品中黄曲霉毒素进行严格的检测与控制。
3结论
采用免疫亲和柱净化,光化学在线衍生,高效液相色谱荧光法检测花生粕中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。
该方法简便快速,准确可靠,灵敏度高,重现性好,能够满足饲料用花生粕中黄曲霉毒素检测的需要。
(基金项目:
国家科技支撑计划项目,项目编号:
2006BAD12B03
参考文献
[1]宋欢.液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素B1[J].山西农业大学学报,2001,3:
257~258.
[2]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T18979-2003.食品中黄曲霉毒素的测定-免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法[S].北京:
中国标准出版社,2003-7-01.
[3]StrokaJ,HoustCV,AnklamE,etal.ImmunoaffinityColumnCleanupwithLiquidChromatographyUsingPost-ColumnBrominationforDeterminationofAflatoxinB1inCattleFeed:
CollaborativeStudy[J].JofAOACInternational,2003,86(6:
1179~1186.
[4]WaltkingAE,WilsonD.LiquidChromatographicAnalysisofAflatoxinUsingPost-ColumnPhotochemicalDerivatization:
CollaborativeStudy[J].JofAOACInternational,2006,89(3:
678~692.
[通讯地址:
北京市海淀区中关村南大街12号,邮编:
100081]
表2回收率及精密度试验结果(n=7
黄曲霉毒素添加量
(μg/kg
测定量
(μg/kg
回收率
(%
相对标准偏差(%
B11.00.8383.016.2109.1491.410.75046.2392.49.5
B20.30.35116.717.83.02.6287.312.61513.2688.411.6
G11.01.14114.012.5109.0590.513.15045.9091.89.2
G20.30.2066.718.23.02.1872.716.21510.0667.112.3
3讨论
植酸酶酶活国标测定法是在BASF和AOAC植酸酶酶活测定法的基础上确立起来的。
在国标法发布之前,我国科学工作者对植酸酶测定方法进行了研究和论证,其中底物建议应用Sigma试剂公司生产的P3168。
而国标测定法发布后对底物的应用只是规定了分子式是C6H6O24P6Na12,而对其他方面没有作详细说明。
Sigma试剂公司生产的底物P0109和P3168的化学式分别为C6H6O24P6Na12・xH2O和C6H6O24P6Na12,绝干状态下相对分子质量都是923.8,是植酸的钠盐形式,其水溶液呈碱性。
底物P3168和P0109在应用pH5.5的乙酸缓冲液配制后pH值达到6.4~6.5,而植酸酶国标法中酶活单位定义是在pH为5.5的条件下测定的。
所以在植酸酶酶活测定过程中,应将底物溶液P3168和P0109的pH校正到5.5。
同样,当在pH5.0条件下检测时也应将底物溶液P3168和P0109的pH校正到5.0。
有研究报道,将植酸钠P3168溶液pH由6.48调至5.5,极显著影响植酸酶活性,未调节pH组植酸酶活性仅相当于调节pH组的66%。
而底物P8810的化学式为C6H18O24P6・xNa・yH2O,相对分子质量是660.3,在应用pH5.5和5.0的乙酸缓冲液配制后底物pH值5.48~5.49和4.98~4.99,未发生很大变化。
但用P8810测定的植酸酶酶活值大于P3168和P0109测定值,这说明不同分子式的底物对植酸酶酶活测定影响很大,所以在应用P8810进行植酸酶酶活测定,不能直接替代使用,必须考虑P8810与P3168之间的换算关系。
植酸钠是影响植酸酶酶活测定结果的重要因素,在测定过程中,如果更换底物的类型和品种,必须对产品进行校正,以便得到正确和统一的酶活测定值。
底物P0109是Sigma试剂公司继P8810推出后不久又一种替代产品,底物P8810现在仍有许多机构在使用,而底物P3168Sigma试剂公司目前已经停止生产。
但是植酸酶制剂市场上的酶活标准大多仍延续着用底物P3168的测定值。
所以正确的掌握底物P0109的检测效果以及3种底物之间的对比关系,对植酸酶的应用至关重要。
参考文献
[1]农业部全国饲料工作办公室.GB/T18634-2002.饲用植酸酶活性的测定(分光光度法[A].饲料工业标准汇编[C].北京:
中国标准出版社,2002.[通讯地址:
北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院饲料研究所,邮编:
100081]
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
34
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 免疫 亲和 光化学 衍生 高效 色谱 荧光 测定 花生 中黄 曲霉
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)