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<621>色谱法

介绍

色谱分离技术是通过样品组分在固定相和流动相两相中的分布差异进行分离的技术。

其中固定相可以是固体、有固相支持的液体或凝胶。

固定相可以填充于柱、分散成层、分布为膜或者应用于其他技术中。

流动相可以为气态、液态或超临界流体。

分离可以基于吸附性、质量分布（分配）或离子交换，也可以基于分子物理化学性质的差异，如大小、质量和体积。

本章节包括了基本步骤、定义和对一般参数的计算并描述了对于系统适应性的基本要求。

在USP中应用于定量和定性分析的色谱方法类型有柱色谱法、气象色谱法、纸色谱法、薄层色谱法（包括高效薄层色谱）和加压液相色谱法（一般称作高压或高效液相色谱）。

基本步骤

本部分描述了使用某种色谱方法的基本步骤。

除另有各论规定外，以下色谱分离方法的步骤将会被遵循。

纸色谱法

固定相：

固定相为一张适当质地和厚度的纸。

色谱图的形成过程可以是上行的，这样溶剂被毛细管作用力支撑着沿着纸向上，这个过程也可以是下行的，在此情况下溶剂流动也受到重力的影响。

与溶剂流动有关的纸张纹理定向应该在一系列色谱图中保持恒定。

（纤维方向通常由制造商在色谱纸的包装上标出。

）

仪器：

纸色谱法的必备仪器包括装有添加溶剂的入口的气密室和短于该室内部高度5cm的耐腐蚀材料支架。

该支架作为用于溶剂槽以及用于抗虹吸棒的支撑，这些抗虹吸棒依次撑起色谱纸。

气密室的底部以规定的容积系统或流动相覆盖。

使用以规定溶剂系统润湿的纸张衬托于气密室的内壁，以增加气密室的溶剂蒸汽饱和度。

斑点：

将待分析的一个或多个物质溶解于适当溶剂中。

以微量吸管吸取适当体积的溶液，其中通常含有1-20µg该化合物，点样为6-10mm大小斑点且斑点间的间隔不小于3cm。

下行色谱法步骤

1.带斑点的色谱纸以抗虹吸棒悬挂在气密室内，该棒将该色谱纸的上端固定在溶剂槽中。

（注：

确保色谱纸挂在抗虹吸棒下的部分自由的悬挂在气密室中，没有接触到支架、室壁或室内的液体。

2.气密室被密闭，以便使该室与色谱纸达到溶剂蒸汽平衡（饱和）释放任何多余压力。

3.在气密室平衡后，将配制好的流动相溶剂通过入口添加到溶剂槽中。

4.关闭入口，且让流动溶剂相沿着色谱纸向下行进需要的距离。

5.从气密室内取出色谱纸。

6.迅速标注溶剂前沿的位置，并干燥色谱纸。

7.直接或用适当措施显示被分离出来的一个或多个药物的斑点位置之后，观察并测量该色谱图。

上行色谱法步骤

1.将流动相加入气密室底部。

2.气密室被密闭，以便使该室与色谱纸达到溶剂蒸汽平衡（饱和）。

在需要时，释放任何多余压力。

3.固定相的下边缘浸入到流动相中以使其通过毛细管作用力支撑着沿着色谱纸向上。

4.当溶剂到达预先设定的高度时，打开气密室，取出色谱纸，迅速标注溶剂前端的位置，并干燥色谱纸。

5.直接或用适当措施显示被分离出来的一个或多个药物的斑点位置之后，观察并测量该色谱图。

薄层色谱法

固定相：

是相当薄的均匀涂层，以干燥、细粉状物料涂于玻璃、塑料、或金属薄片或薄板（通常统称为薄板）。

薄层色谱板的固定相的平均粒子尺寸为10－15µm，而高效薄层色谱板为5µm。

如果在各论中有相关规定，则可以使用带有预吸附区域的市售薄板。

样品点于预吸附区域应在预吸附－吸附剂表面上形成的尖锐、狭窄的区间。

分离的实现是基于吸附性、分配或双方的结合效率依赖于固定相的特殊性。

仪器：

色谱室需由惰性、透明物质构成的，并符合以下标准：

平底或双槽，能盖严密的盖子和适于薄板的尺寸。

将色谱室内至少一侧内壁衬以滤纸。

将相对色谱室大小而言足够量的流动相倒入该室，以便在加入滤纸之后在能合适于薄板大小的深度。

为了饱和色谱室，盖上盖子，并使该系统达到平衡。

（注：

除另有规定，色谱分离都需要在饱和的色谱室内进行）。

检测：

适用于在短波（254nm）和长波（365nm）下观察的紫外光源以及能使斑点显现的一系列试剂。

斑点：

使用规定体积的供试溶液和标准溶液，分成足够多的小份进行点样，以得到直径2-5mm（在高效薄层色谱板上为1-2mm）的圆形斑点或者10-20mm×1-2mm（在高效薄层色谱板上为5-10mm×0.5-1mm）带状斑，并与下边缘和薄板的侧面保持适当距离。

【注：

在色谱过程中，点样位置必须在展开溶剂水平面至少3mm（高效薄层色谱法）至5mm（薄层色谱法）以上。

】将这些溶液点在平行于该薄板下边缘的直线上，并且斑点的中心之间距离至少10mm（在高效薄层色谱板上5mm）或者带状斑边缘之间的距离至少4mm（在高效薄层色谱板上2mm），并待其变干。

步骤：

1.将薄板放入色谱室内，确保斑点或带状斑在流动相的表面之上。

2.关闭色谱室。

3.允许流动相上行至薄板的四分之三位置处或在各论中规定的距离。

4.取出薄板，用铅笔标注溶液前行所至的位置并干燥薄板。

5.按规定将色谱显色。

6.确定基本斑点或区域的比移值（RF）。

7.推定鉴别能够这样实现，分别使用未知样品和标准物质样品在同一块薄板上进行层析，并观察所得结果中RF值完全相同且大小大致相等的斑点或区域。

对于斑点或区域的大小或亮度可视性比较可用于半定量估测。

用于薄板上直接定量测量的仪器是一个光密度计（吸收率或荧光测定）。

柱色谱法

固相载体：

纯硅质土用作普通分离。

硅烷化的色谱纯硅质土用作反相分配色谱法分离。

固定相：

载体通过添加各论中规定的固定相做出修改。

如果液体混合物要用作固定相，应在加入载体物前要预先混合好。

流动相：

流动相在各论中分别进行规定。

如果固定相是一种水溶液，用水使其平衡。

如果固定相是一种极性有机液体，用该液体使其平衡。

仪器：

除非在具体各论中另有规定，色谱柱的内径为约22毫米，长度为200至300毫米。

附内径约4毫米、长度约50毫米、不带旋塞的导管。

仪器准备：

将一缕玻璃棉填充在色谱柱底部。

将规定体积的固定相与指定数量的载体相混合成一个均质、蓬松的混合物。

转移该混合物至色谱柱，并用轻柔压力捣实，以获得一个均匀结块。

如果指定数量的载体多于3克，将此混合物以约2克每份转移至色谱柱，并捣实每个部分。

如果定量测定或检验需要每段指定不同的固定相的多段柱，则在加入并捣实一段后，直接在此前的段上加入下一个连续部分。

将一缕玻璃棉填充在装好的色谱柱上。

【注：

流动相适度地流过，或者在反相色谱法中缓慢滴过一个适当填充柱。

】

如果被分析物的溶液被混合到固定相中，使用约1克载体和若干滴用于配制供试溶液的溶剂组成的混合物来擦洗用于制备供试混合物的烧杯，以完成向色谱柱的定量转移。

将一团细玻璃棉装填在已装柱的柱填料上。

步骤：

1.将流动相转移至柱内置于柱填料上面，并使其在重力影响下沿柱流下。

2.在每次变更流动相组成之前和洗脱完成之后，以约1毫升流动相冲洗色谱柱顶端。

3.如果被分析物作为在流动相中的溶液被加入到色谱柱中，则使其彻底渗入柱填料中，然后在加入大量流动相之前，加入若干小份流动相，使每一份彻底渗下去。

4.如定量测定或检验需要使用连续安装的多重色谱柱并且已规定流动相分成几份加入，则让每一份彻底渗入每个色谱柱，并在加入后续部分之前以流动相冲洗每个色谱柱顶部。

气象色谱法

液体固定相：

此类型的固定相可见于填充柱或毛细管柱中。

气象填充柱：

在填充柱中，液体相置于一种精细分割的惰性载体上，例如硅藻土、多孔聚合物、石墨化碳，而该载体装填到通常内径2至4毫米、长度1至3米的色谱柱中。

气象毛细管柱：

在毛细管柱中，此类色谱柱不含填料，液体相涂于色谱柱的内表面上并且可能用化学键合于其上。

固体固定相：

此类型固定相仅适用于填充柱。

在此类型的柱中，固体相是填充于色谱柱中的一种活性吸附剂，如铝、硅或碳。

聚芳烃多孔树脂，时常用于填充柱中，不涂布液相。

（注：

填充柱和毛细管柱在使用前要调整至基线和其他性质稳定。

色谱柱和填充材料的供应商要对建议的调整步骤提供介绍。

）

仪器：

气相色谱仪包含载气源、气化室、色谱柱、检测器和记录设备。

气化室、色谱柱、检测器都是温度受控的，且温度的变动亦作为分析的一部分。

常见载气有氦气、氮气、或氢气，根据使用的色谱柱和检测器进行选择。

检测器输出的数据记录为时间函数，并且设备的响应值，以峰面积或峰高来衡量，是其数量的函数。

温度程序：

气象色谱分离的长度和质量可以由改变色谱柱的柱温来进行控制。

当需要设置温度程序时，另有各论会对条件以表格的形式进行规定。

表格中规定了起始温度，温度变化速率，最终温度和最终温度的保留时间。

步骤：

1.用流动的载气平衡色谱柱、进样器和检测器直至获得恒定的信号。

2.通过进样膜或自动进样器进一份样品。

3.开启温度程序。

4.记录色谱。

5.按各论规定进行分析。

液相色谱法

此纲要中所应用的液相色谱法等同于高压液相色谱和高效液相色谱。

液相色谱法是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术。

固定相：

分离的实现通过分配、吸收或离子交换，取决于所用的固定相。

最常用的固定相是改造硅胶或聚合物颗粒。

颗粒通过加入长链碳氢化合物进行改造。

为完成分析而进行的特殊的填充类型，需要按照各论中的指示“L”（见下色谱柱部分）。

颗粒的大小通常也在各论中进行规定。

填充类型和大小的变化在本章节的系统适用性部分也进行了描述。

色谱柱：

色谱柱包括填充了固定相的不锈钢柱、线性的不锈钢柱和聚合物柱。

色谱柱的长度和内径影响着分离程度，因此柱子的大小在各论中分别有规定。

柱子大小的变化在本章的系统适用性部分也作了相关讨论。

纲要中不再包括色谱柱的名称；此处省略以避免出现对供应商的产品名及产地的变化的认可。

详见色谱柱部分。

流动相：

流动相为溶剂或溶剂混合物，在各论中均有所规定。

仪器：

液相色谱仪由装有流动相的贮液器、以高压推动流动相通过系统的泵、将样品注入到流动相的进样器、色谱柱、检测器和数据采集装置。

梯度洗脱：

在色谱仪器运行过程中持续改变溶剂组成的方法被称为梯度洗脱或溶剂程序化。

梯度洗脱通常以表格的形式在各论中进行规定，其中包括运行时间和流动相在不同时间的成分比例。

步骤：

1.使用流动相在特定的流速下平衡色谱柱和检测器直至得到恒定的信号。

2.通过进样器或使用自动进样器进样。

3.启动梯度程序。

4.记录色谱。

5.按各论进行分析。

色谱柱

用于USP-NF检测中的填料（L）、相（G）、载体（S）的完整清单位于试剂、指示剂、溶液部分中的色谱试剂项下。

此清单是为了方便色谱操作者参考，以识别在具体各论中规定的相关色谱试剂。

色谱相关定义和解释

色谱图：

一张色谱图是用图示的形式展现了检测器的响应、流出物中的待分析物的浓度或用以定量测定流出物浓度或与之相对应的流出体积或时间。

在平面色谱法中，色谱图参考纸或薄层的不同区域。

图1代表了两种物质（物质1和2）的典型色谱分离，其中t1和t2是各自的保留时间，h、h/2、和Wh/2分别是峰1的峰高、半峰高、半峰宽。

W1和W2分别是峰1和2的峰宽。

各空气峰是气相色谱图的一个特征，就像在液相色谱法中的前面的溶剂峰一样。

这些未保留组分的保留时间被指定为tM。

图一.两种物质的分离色谱图

滞后体积（D）：

（也作梯度延迟体积）指洗脱物出现的点到柱头这一段的体积。

死时间（tM）：

死时间指不被固定相吸附的组分洗脱出来所需的时间（见图1，以空气峰或不吸附物峰的形式，在基线上以min为单位）。

死体积（VM）：

死体积指不被固定相吸附的组分洗脱出来所需的流动相的体积。

它可以由死时间和流速来计算，以mm/min为单位：

VM=tM×F

在分子排阻色谱法中，用符号V0表示。

理论塔板数（N）:

理论塔板数N是柱效的衡量方法。

对于高斯峰，通过此公式来计算：

N=16（tR/W）2

其中，tR是该物质的