制革废水的耐铬菌选育.docx
- 文档编号:27227344
- 上传时间:2023-06-28
- 格式:DOCX
- 页数:23
- 大小:58.68KB
制革废水的耐铬菌选育.docx
《制革废水的耐铬菌选育.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《制革废水的耐铬菌选育.docx(23页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
制革废水的耐铬菌选育
本科毕业论文
(2008 届)
题目:
皮革废水中耐铬菌的选育
学院:
生命与环境科学学院
专 业:
生物科学
班 级:
04生科本
姓名:
罗清应
学号:
04081101
指导老师:
葛世玫讲师
完成日期:
2008年6月13日
皮革废水中耐铬菌的选育
作者:
罗清应指导老师:
葛世玫
(温州大学生环学院,浙江温州,325207)
摘要:
从温州制革基地的皮革废水及其污染的水样和土样中分离选育得4株对六价铬具有一定去除能力的耐铬菌株,为3株革兰氏阳性菌和1株革兰氏阴性菌,初步分析它们为不同种或属的菌株。
其耐铬性最高为950mg/L,对200mg/L重铬酸钾的溶液中去除率最高为78.42%。
重金属抗性及抗生素抗性实验结果表明,其中1#菌株对所供试的8种重金属中多数都有抗性,其应用潜力最大,而4株耐铬菌对7种常用的抗生素表现较为敏感。
关键词:
皮革废水;耐铬菌;铬去除率;
Isolationofchromium-resistantbacteriafromtheeffluentsoftanneries
Author:
LuoQingYingSupervior:
GeShimei
(TheSchoolofLifeandEnvironmentalSciences,
WenzhouUniversity,Wenzhou,Zhejiang,325207)
Abstract:
Fourchromium-resistantbacteriawhichhavethebiodegradationabilityofhexavalentchromium(Cr6+)wereisolatedfromtheeffluentsoftanneriesandpollutedwaterandsoilinWen-zhoucity.Threechromium-resistantbacteriaisG+,andanotheroneisG-.Analysisshowedtheyaredifferentkindsofbacteria.Theyareresistantto950mg/LK2Cr2O7,and78.42%ofCr6+canbebiodegradatedatmaxium.Experimentsshowedthestrain1#havethecertainresistancetootherheavymetalsandhavetherelativelystrongpotentialtoappliance.Thefourdifferentskindsofchromium-resistantbacteriaareallsensitivetosevencommonantibiotics.
Keywords:
theeffluentsoftanneries,thechromium-resistantbacteria,biodegradationabilityofCr6+
前言:
天然皮革及制品的应用日趋广泛,带来了皮革业发展的同时,皮革废水及副产品排放量的增大也随之给环境造成了很大的污染。
自19世纪使用铬盐作为鞣剂以来,铬盐就一直是制革工业的主要鞣剂。
但铬盐在生产过程中吸收不完全,大约有25%的铬盐要排放到污水中,在铬鞣废液中平均铬含量大约在3000-4000mg/L,即使在制革总废水中铬的含量也高达10-70mg/L。
目前,对于皮革工业废水中铬的处理方法通常有两类:
一是用化学法、电化学还原法等将制革废液中的铬转化为不溶或难溶物,如氢氧化铬除去;二是在不改变铬的化学形态下,采用电渗析法、离子交换法和活性炭吸附等方法将其进行浓缩分离。
但这些方法无一不具有投资大、运行费用高、产生污泥量大、易造成二次污染等问题。
如果采用微生物法处理制革废水中铬,其投资和运行费用都会显著降低、且没有二次污染等明显的优势使得此法具有长远的前景。
但鉴于现在生物法处理含铬废水技术,是依靠人工培养的功能菌,它具有静电吸附作用、酶的催化转化作用、络合作用、絮凝作用、包藏共沉淀作用和对pH值的缓冲作用等,由于实际条件的种种因素,该法与实际应用尚有一定距离。
而且皮革工业废水的成份复杂,除铬外,还含有硫化物和其它悬浮物等,其BOD、COD、pH值和盐度都较高,其中部分物质还对微生物的活性和去除效率会产生压制作用。
Srivastava等从皮革废水中分离得到除铬真菌Asperigillussp.和Hirsutellasp.,在2升容积的生物反应器中处理铬酸钾溶液7天后,可以去除85%,而采用同样条件处理皮革废水则只能去除铬65%。
微生物的特点决定了皮革废水的处理和运行与其它废水处理存在一定的差异,适用于其它废水中铬处理的微生物未必能应用到皮革废水中铬的治理中去。
因此,专门针对皮革废水,研究去除铬的微生物是有必要的。
1.材料与方法
1.1实验仪器与设备
TU-1810紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司
生物显微镜北京泰克仪器有限公司
BS2243d=0.0001g电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司
PSX智能型恒温恒湿培养箱宁波莱福科技有限公司
TGL-16G离心机上海安亭科学仪器制造厂
LD2X-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂
SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台苏州净化设备有限公司
双层气温度恒温摇床上海智城分析仪器制造有限公司
吉尔森P型移液器P100上海华运分析仪器有限公司
吉尔森P型移液器P1000上海华运分析仪器有限公司
751玻璃比色皿宜兴市晶科光学仪器有限公司
1.2实验所用试剂
培养基I(液体)
蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,蒸馏水稀释至1000ml,并用20%NaOH调节PH至7.2左右。
121℃,.0.1Mpa高温高压灭菌20分钟,冷却后备用。
培养基II(固体)
蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,蒸馏水稀释至1000ml,并用20%NaOH调节PH至7.2左右,加入琼脂15g。
121℃,.0.1Mpa高温高压灭菌20分钟,冷却后备用。
重铬酸钾溶液:
称取5g重铬酸钾固体,溶于100ml蒸馏水中。
1+1硫酸:
取50ml硫酸加水定容到100ml。
1+1磷酸:
取50ml磷酸加水定容到100ml。
铬标准贮备液:
称取于110℃干燥2h的重铬酸钾(K2Cr2O7优级纯)0.2829±0.0001g用水溶解后移入1000mL容量瓶中用水稀释至标线摇匀此溶液1mL含0.10mg六价铬。
铬标准溶液:
吸取25.00mL铬标准贮备液(3.7)置于500mL容量瓶中用水稀释至标线摇匀此溶液1mL含5.00ìg六价铬使用当天配制此溶液。
显色剂:
称取二苯碳酰二肼(C13H14N4O)0.2g溶于50mL丙铜中加水稀释至100mL摇匀贮于棕色瓶置冰箱中,色变深后不能使用。
结晶紫染液:
结晶紫酒精饱和液(10%)20mL
1%草酸铵水溶液80mL
将两液混匀置24h后过滤即成。
此液不易保存,如有沉淀出现,需重新配制。
卢戈(Lugol)氏碘液:
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300mL
配制:
先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾,再加入碘,使之溶解,最后加蒸馏水至300mL。
配成后贮于棕色瓶内备用,如变为浅黄色即不能使用。
稀释石炭酸复红溶液
碱性复红1g
95%乙醇l0mL
5%石炭酸90mL
混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液,取石炭酸复红饱和液l0mL加蒸馏水90mL即成。
重金属溶液:
0.1MNa2MoO4溶液:
称取Na2MoO4·2H2O固体2.4195g溶于100mL蒸馏水中。
0.1MCuSO4溶液:
称取CuSO4·5H2O固体2.4968g溶于100mL蒸馏水中。
0.1MMnSO4溶液:
称取MnSO4·H2O固体1.6902g溶于100mL蒸馏水中。
0.1MAgNO3溶液:
称取AgNO3固体1.6988g溶于100mL蒸馏水中。
0.1MFeCl3溶液:
称取FeCl3·6H2O固体2.7029g溶于100mL蒸馏水中。
0.1MCoCl2溶液:
称取CoCl2·6H2O固体2.3793g溶于100mL蒸馏水中。
0.1MNiSO4溶液:
称取NiSO4·6H2O溶液2.6285g溶于100mL蒸馏水中。
0.1MZnSO4溶液:
称取ZnSO4·7H2O固体2.8756g溶于100mL蒸馏水中。
抗生素:
100mg/ml卡那霉素(KM)、100mg/ml氨苄青霉素(AM)、100mg/ml红霉素(EM)、100mg/ml青霉素(AEO)、100mg/ml氯霉素(CM)使用浓度的配制:
用分析天平分别精确称取1000mg相应的抗生素溶于10ml无菌水中,再用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
5mg/ml四环素(TC)的配制是称取50mg卡那霉素溶于10ml无菌水中,再用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌。
40mg/ml庆大霉素(GM)使用的是购买时的针剂液体。
1.3样品采集地点
温州制革基地多家皮革厂及制革废水处理厂周边的污水及土壤
1.4菌株保存
采用甘油冷冻保存法和斜面石蜡封存法
1.5实验方法
1.5.1菌种初筛
采用稀释平板法,对水样作连续的10倍系列稀释,制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个梯度稀释菌液。
对土样,去10g土样加无菌水100ml,再作连续的10倍系列稀释,制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个梯度稀释菌液。
从这些稀释菌液中各取50μL分别涂布用于初筛的培养基平板,分别放在细菌培养箱(30℃)里培养48小时,观察菌落生长状况。
1.5.2菌种复筛及耐铬性实验
选取合适的平板选取的挑取合适的菌落接种到Cr(VI)200mg/L的培养基上,编号,观察菌落生长情况.在该基础上长出的菌落再接种到200mg/L,250mg/L,300mg/L,350mg/L,400mg/L,450mg/L,500mg/L,550mg/L,600mg/L,650mg/L,700mg/L,750mg/L,800mg/L,850mg/L,900mg/L,950mg/L,1000mg/L重铬酸钾溶液的培养基上,传代三次,并观察菌落生长情况
1.5.3分离纯化
选取合适的菌落利用分区划线法传代培养进行分离纯化得到单一菌落
1.5.4铬浓度标准曲线
采用二苯碳酰二肼分光光度法。
1.5.5耐铬菌铬去除率的测定(二苯碳酰二肼分光光度法)
采用液体培养基,添加重铬酸钾溶液,配制成200mg/L的重铬酸钾浓度,吸取1ml培养液,用紫外分光光度计测量其中的铬离子浓度。
接种菌株,摇床培养48小时再取样测量一次铬离子浓度,及72小时和96小时各再一次
求取铬去除率=(初始浓度-剩余浓度)/初始浓度
1.5.6菌种的初步鉴定
菌种鉴定方法:
对培养24h的耐受力最强的菌株进行革兰氏染色和显微观察,根据培养形态和革兰氏染色结果对其进行初步判定。
A:
革兰染色方法:
①在一洁净的载玻片中央滴一滴生理盐水,用事先灭菌的牙签取适量耐铬细菌和大肠杆菌一同涂于其上,涂布均匀后置于通风处晾干。
②将晾干的片子背面在酒精灯上快速地过一两遍以固定细胞。
③滴一滴草酸铵结晶紫于细胞上初染1分钟,后用蒸馏水轻轻地冲洗干净。
④滴加碘液媒染1分钟,后再用蒸馏水冲洗干净。
⑤用95%乙醇脱色10秒钟左右,快速用蒸馏水冲洗干净。
⑥用番红进行复染2分钟,最后再用蒸馏水冲洗干净,晾干后置于显微镜下进行观察。
B:
显微镜观察及菌落形态观察:
在染色标本片上滴加香柏油于显微镜下观察,同时将该菌株接种在LB固体培养基上30℃培养48h后观察单菌落形态及镜检。
1.5.7菌种的重金属抗性实验
在LB培养基上分别加入不同类型、不同浓度的重金属溶液,将所筛选出来的菌株接种上述培养基上培养48小时,观察其生长状况。
1.5.8菌种的抗生素抗性实验
在LB培养基上分别加入不同类型、不同浓度的抗生素,将所筛选出来的菌株接种上述培养基上培养48小时,观察其生长状况。
2.结果和讨论
2.1菌种初筛
采用稀释平板法,对水样和土样作适当的处理后,均匀涂布在添加有200mg/L重铬酸钾浓度的的LB培养基平板上,30℃条件恒温培养48小时,观察菌落生长状况。
结果表明不同的水样或土样在浓度10-2、10-3、10-4范围内能够分别长出分散良好的单个菌落。
根据菌落大小、颜色和形态,挑取适当数量的不同菌落再转接到LB培养基平板(同样添加有200mg/L重铬酸钾浓度的培养基进行培养,这些菌株即作为初筛出的菌种,约有500株左右。
将其编号供进一步检测。
2.2菌种复筛
2.2.1菌株的耐铬性检测实验
将上述初筛出的菌株再接种到200mg/L,250mg/L,300mg/L,350mg/L,400mg/L,450mg/L,500mg/L,550mg/L,600mg/L,650mg/L,700mg/L,750mg/L,800mg/L,850mg/L,900mg/L,950mg/L,1000mg/L的重铬酸钾培养基上,传代三次,并观察菌落生长情况,部分菌株的耐铬性检测见表1。
表1部分菌株的耐铬性
Tab1theresistanceoftheCRBtochromium
200
300
400
500
600
700
800
900
950
1000
1#
++
++
++
++
++
+
-
0
0
0
4#
++
+
-
-
0
0
0
0
0
0
5#
++
++
++
+
+
-
0
0
0
0
8#
++
++
++
+
+
-
0
0
0
0
12#
++
-
0
0
0
0
0
0
0
0
14#
++
++
+
-
0
0
0
0
0
0
15#
++
+
-
0
0
0
0
0
0
0
16#
++
-
0
0
0
0
0
0
0
0
18#
++
++
+
-
0
0
0
0
0
0
19#
++
++
++
+
-
0
0
0
0
0
23#
++
+
+
-
0
0
0
0
0
0
24#
++
++
++
-
0
0
0
0
0
0
31#
++
++
+
-
-
0
0
0
0
0
44#
++
++
+
-
0
0
0
0
0
0
52#
++
-
-
0
0
0
0
0
0
0
58#
++
++
++
+
0
0
0
0
0
0
64#
++
++
++
+
0
0
0
0
0
0
65#
++
++
++
++
+
-
0
0
0
0
67#
++
++
++
++
++
++
+
+
-
0
70#
++
++
++
+
-
0
0
0
0
0
74#
++
++
+
-
0
0
0
0
0
0
76#
++
++
++
++
+
-
0
0
0
0
79#
++
++
++
+
-
0
0
0
0
0
80#
++
++
++
++
++
++
+
+
-
0
82#
++
++
++
+
-
0
0
0
0
0
83#
++
++
++
++
+
-
0
0
0
0
84#
++
++
++
+
+
+
+
+
0
0
94#
++
-
0
0
0
0
0
0
0
0
96#
++
+
-
0
0
0
0
0
0
0
100#
++
++
++
++
+
-
0
0
0
0
101#
++
-
0
0
0
0
0
0
0
0
102#
++
++
++
++
+
-
0
0
0
0
103#
++
++
-
+
+
+
+
+
0
0
注:
表中200-1000为重铬酸钾浓度,单位为mg/L;“++”表示生长状况良好,“+”表生长状况一般,“-”表有生长但明显受到抑制,“0”表示完全不能生长。
由表1所示部分菌株对铬耐受性实验结果可以看出,菌株对六价铬的耐受浓度有明显不同,最高可以在950mg/L的浓度上生长,但其生长已受到抑制(70#和80#),在1000mg/L浓度的重铬酸钾条件下其生长完全受到抑制,不能生长。
这说明六价铬对微生物的生长的确起到不利的影响,这已在其它学者的研究中被证实。
研究表明:
铬在自然界中有多种化合价态,但以六价铬的毒性最强,它的毒性比三价铬强100倍。
因为六价铬容易透过细胞膜渗入细胞,进入细胞后六价铬会以不同的化学形态与细胞内大分子相结合,引起遗传密码的改变,进而引起细胞的突变和癌变。
反之,能够在高含量的六价铬环境中生长的微生物是必须在长时间的自然选择中,由菌株自身的遗传、生理等条件的改变才能保存它们在诸如高含量的六价铬等不利环境中生长繁殖。
因此,从这点可以看出,能够抗高浓度六价铬的微生物菌株应该是有不同于其它在正常环境中生长的菌株的细胞结构或生理生化等特性的。
为了增进了解这些在不利环境中能够生长的耐铬菌株,这里选取了耐铬浓度较高的100株菌作为研究对象,检测它们对六价铬是否具有去除能力。
2.2.2铬浓度测定的标准曲线
量取铬标准储备液,用50ml容量瓶分别制取0.00mg/L,0.02mg/L,0.04mg/L,0.08mg/L,0.12mg/L,0.16mg/L,0.20mg/L铬标准使用液,添加1+1硫酸和1+1磷酸,摇晃混合均匀,再添加显色剂,摇晃混合均匀,放置5~10min完全显色后,在波长540nm处,用光程10nm比色皿,以蒸馏水为参比进行吸光度的测量,得到Abs,绘制以溶液铬浓度(mg)对校正吸光度的校准曲线。
结果见表2。
标准曲线见图1。
表2铬浓度测定标准曲线
Tab2Concentrationofchromiumstandardcurve
样品1
样品2
样品3
样品4
样品5
样品6
样品7
样品Cr6+浓度(mg/L)
0.00
0.02
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
Abs
0.002
0.016
0.034
0.064
0.093
0.129
0.170
图1铬浓度标准曲线
Fig1Concentrationofchromiumstandardcurve
2.2.3铬去除率测定
将上述选取的耐铬浓度较高的100株菌进行铬去除率的测定,测定方法采用的是二苯碳酰二肼分光光度法,部分菌株的铬去除率结果见表3。
表3部分菌株的铬去除率
Tab3thechromiumremovalrateoftheCRB
编号
起始六价铬浓度
48h六价铬浓度
去除率
72h六价铬浓度
去除率
96h六价铬浓度
去除率
70#
73.67
64.13
12.95%
58.3
20.86%
15.9
78.42%
84#
62.01
55.12
11.11%
48.23
22.22%
22.79
63.25%
1#
63.07
40.28
36.13%
34.98
44.54%
30.74
51.26%
76#
69.43
49.29
29.01%
41.87
39.69%
34.45
50.38%
67#
62.01
50.88
17.95%
41.34
33.33%
34.45
44.44%
79#
69.43
55.65
19.85%
47.17
32.06%
40.81
41.22%
74#
73.67
58.83
20.14%
53.212
27.77%
49.29
33.09%
44#
72.08
68.37
5.15%
65.243
9.49%
50.35
30.15%
8#
72.08
61.48
14.71%
59.89
16.91%
50.35
30.15%
14#
74.2
65.19
12.14%
54.484
26.57%
52.47
29.29%
80#
69.43
56.18
19.08%
50.88
26.72%
50.88
26.72%
82#
69.43
52.47
24.43%
56.71
18.32%
50.88
26.72%
65#
62.01
53.53
13.68%
56.71
8.55%
46.11
25.64%
80#
69.43
55.12
20.61%
57.24
17.56%
51.94
25.19%
64#
74.2
59.36
20.00%
61.48
17.14%
55.65
25.00%
24#
74.73
62.54
16.31%
58.141
22.20%
56.18
24.82%
58#
73.67
57.24
22.30%
64.13
12.95%
55.65
24.46%
23#
71.02
57.24
19.40%
56.18
20.90%
54.06
23.88%
31#
73.67
62.01
15.83%
59.89
18.71%
58.83
20.14%
18#
70.49
64.13
9.02%
59.678
15.34%
56.71
19.55%
5#
63.07
55.12
12.61%
53.53
15.13%
50.88
19.33%
102#
60.42
58.83
2.63%
54.06
10.53%
50.88
15.79%
83#
62.01
54.06
12.82%
59.89
3.42%
53
14.53%
100#
60.42
53
12.28%
57.24
5.26%
53.53
11.40%
注:
表中六价铬浓度单位为mg/L。
由表3可以看出,96小时铬去除率的测定结果中,以70#去除率最高,达到78.42%。
结合表1结果发现,70#菌株的耐铬浓度也是最高(可以在950mg/L的浓度上生长),并且76#(去除率50.3
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 制革 废水 耐铬菌 选育