革兰氏染色的一般步骤.docx
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革兰氏染色的一般步骤
革兰氏染色的一般步骤
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实验三细菌的革兰氏染色法
一、目的要求
了解革兰氏染色的原理,学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法(Gramstain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:
染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液:
碱性染料(basicdye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decoorisingagent)和复染液(counterstain)。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystavioet)。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘(iodine)是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精(ethano)。
复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,从而将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液是番红。
三、器材
大肠杆菌,金黄色葡萄球菌;
草酸铵结晶紫,番红水溶液,碘液,95%乙醇,载玻片,显微镜等。
四、操作步骤
1.涂片
将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),自然干燥、固定。
固定时通过火焰1~2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。
2.染色
(1)初染:
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)一滴,染色1-2min,倾斜后缓慢冲洗,用吸水纸吸干。
(2)媒染:
滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,倾斜后缓慢冲洗,吸水纸吸干。
(3)脱色:
将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,倾斜玻片,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20~30秒钟,立即用水冲净酒精。
(4)复染:
用番红液染1~2分钟,水洗。
(5)镜检:
自然干燥后,置油镜观察。
革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。
(6)同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片,作革兰氏染色对比。
注意:
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。
此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。
五、实验结果与讨论
微生物染色液的配制
一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液
A液:
美蓝(methyleneblue)0.6g
95%酒精30ml
B液:
KOH0.01g
蒸馏水100ml
分别配制A液和B液,配好后混合即可。
二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液
A液:
碱性复红(basicfuchsin)0.3g
95%酒精10ml
B液:
石炭酸5.0g
蒸馏水95ml
将碱性复红在研钵中研磨后,逐渐加入95%酒精,继续研磨使其溶解,配成A液。
将石炭酸溶解于水中,配成B液。
混合A液及B液即成。
通常可将此混合液稀释5—10倍使用,稀释液易变质失效,一次不宜多配。
三、革兰氏(Gram)染色液
1.草酸铵结晶紫染液
A液:
结晶紫(crystalviolet)2g
95%酒精20ml
B液:
草酸铵(ammoniumoxalate)0.8g
蒸馏水80ml
混合A、B二液,静置48小时后使用。
2.卢戈氏(Lugol)碘液
碘片1.0g
碘化钾2.0g
蒸馏水300ml
先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘片溶解在碘化钾溶液中,待碘全溶后,加足水分即成。
3.95%的酒精溶液(脱色用)。
4.番红复染液
番红(safranineO)2.5g
95%酒精100ml
取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。
四、芽孢染色液
1.孔雀绿染液
孔雀绿(malachitegreen)5g
蒸馏水100ml
2.番红水溶液
番红0.5g
蒸馏水100ml
3.苯酚品红溶液
碱性品红11g
无水酒精100ml
制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合,过滤备用。
4.黑色素(nigrosin)溶液
水溶性黑色素10g
蒸馏水100ml
称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中,置沸水浴中30分钟后,滤纸过滤二次,补加水到100ml,加0.5ml甲醛,备用。
五、荚膜染色液
1.黑色素水溶液
黑色素5g
蒸馏水100ml
福尔马林(40%甲醛)0.5ml
将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟,然后加入福尔马林作防腐剂。
2.番红染液
与革兰氏染液中番红复染液相同。
六、鞭毛染色液
A液:
单宁酸5g
FeCl31.5g
蒸馏水100ml
福尔马林(15%)2.0ml
NaOH(1%)1.0ml
配好后,当日使用,次日效果差,第三日则不宜使用。
B液:
AgNO32g
蒸馏水100ml
待AgNO3溶解后,取出10ml备用,向其余的90mlAgNO3中滴入浓NH4ON,使之成为很浓厚的悬浮液,再继续滴加NH4OH,直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。
再将备用的10mlAgNO3慢慢滴入,则出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状沉淀又消失,再滴入AgNO3,直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。
如所呈雾不重,此染剂可使用一周,如雾重,则银盐沉淀出,不宜使用。
七、富尔根氏核染色液
1.席夫氏(Schiff)试剂
将1g碱性复红加入200ml煮沸的蒸馏水中,振荡5分钟,冷至50℃左右过滤,再加入1mol/LHC120ml,摇匀。
待冷至25℃时,加Na2S2O5(偏重亚硫酸钠)3g,摇匀后装在棕色瓶中,用黑纸包好,放置暗处过夜,此时试剂应为淡黄色(如为粉红色则不能用),再加中性活性炭过滤,滤液振荡1分钟后,再过滤,将此滤液置冷暗处备用(注意:
过滤需在避光条件下进行)。
在整个操作过程中所用的一切器皿都需十分洁净、干燥,以消除还原性物质。
2.Schandium固定液
A液:
饱和升汞水溶液
50ml升汞水溶液加95%酒精25ml混合即得。
B液:
冰醋酸
取A液9毫升+B液1毫升,混匀后加热至60℃。
3.亚硫酸水溶液
10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml,1mol/LHCl5ml,加蒸馏水100ml混合即得。
八、Bouin氏固定液
苦味酸饱和水溶液75ml
福尔马林(40%甲醛)25ml
冰醋酸5ml
1g苦味酸可制成75ml饱和水溶液。
先将苦味酸溶解成水溶液,然后再加入福尔马林和冰醋酸摇匀即成。
九、乳酸石炭酸棉蓝染色液
石炭酸10g
乳酸(比重1.21)10ml
甘油20ml
蒸馏水10ml
棉蓝(cottonblue)0.02g
将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解,然后加入乳酸和甘油,最后加入棉蓝,使其溶解即成。
十、瑞氏(Wright)染色液
瑞氏染料粉末0.3g
甘油3ml
甲醇97ml
将染料粉末置于干燥的乳缽内研磨,先加甘油,后加甲醇,放玻璃瓶中过夜,过滤即可。
十一、美蓝(Levowitz-Weber)染液
在52ml95%酒精和44ml四氯乙烷的三角烧瓶中,慢慢加入0.6g氯化美蓝(methylenebluechloride),旋摇三角烧瓶,使其溶解。
放5—10℃下,12—24小时,然后加入4ml冰醋酸。
用质量好的滤纸如WhatmanNo.42或与之同质量的滤纸过滤。
贮存于清洁的密闭容器内。
图片-铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌-显微图片
破伤风梭菌
大肠杆菌
志贺菌革兰染色
伤寒沙门菌革兰染色
念球菌病直接镜检结核分枝杆菌
肉毒杆菌
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