线虫RNA干扰的基因沉默.docx

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线虫RNA干扰的基因沉默

线虫RNA干扰的基因沉默

一、实验背景及目的

1、RNA干扰（RNAi）是一种使基因使失活的有效方法，在线虫中，RNA干扰因为简单快速成为研究基因功能的有效手段。

2、秀丽线虫是一种生活在土壤中的线虫，长约1mm，直径70um，由959个细胞组成。

它具有生活周期短、易培养和保存等优点。

秀丽线虫具有雌雄同体和雄性个体两种性别。

雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。

其基因组大小为80Mb，包含13000个基因。

秀丽线虫在20℃时生活周期为3.5天，25℃时约为3天，15℃时约为6天。

受精卵经过胚胎发生孵化出L1、L2、L3、L4，最后成为成熟的幼虫。

当食物缺乏或群体密度过大等环境不良的条件时，L2会不进入L3而成为dauer幼虫来抵御不良环境，当环境恢复后dauer幼虫不经过L3直接进入L4。

因此可以利用该特性保存线虫品系。

3、RNAi是一种基因knockdown技术，将体外合成的含有目的基因的dsRNA通过某种方式引入到线虫体内，导致其体内相应的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。

通过显微注射dsRNA或者把线虫浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能够表达dsRNA的大肠杆菌喂食线虫，可以将dsRNA导入大肠杆菌中。

在大肠杆菌HT115中，含有目的基因发夹结构的质粒，在IPTG的诱导下转录出正义和反义的RNA,两条RNA链通过退火形成dsRNA。

当线虫以此大肠杆菌为食时，他们就摄取了大肠杆菌合成的dsRNA，并触发了线虫体内RNA干扰的发生。

4、本实验将利用表达tag--214dsRNA大肠杆菌喂食线虫来介导RNAi，以达到鉴定tag--214基因功能以及观察实验效果的目的。

2、实验材料及试剂

1、材料：

1）秀丽线虫（C.elegans）rrf-3突变体（RNAi敏感型）

2）大肠杆菌（E.coli）野生型菌株OP50

3）带有tag-214发夹结构质粒的HT115菌株。

2、试剂：

1）NGM普通固体培养基

2）含有Amp+和IPTG的NGM固体培养基（用于RNAi）

3）LB培养基

4）M9缓冲液

3、实验操作

由于此次试验培养基配制以及大肠杆菌培养等的前期过程是由两个大组分别进行的，我询问了第二大组的实验相关步骤，但还是会有纰漏，所以有些实验过程和实际的操作会有差错，有些细节也会省略。

1、配制NGM固体平板，M9缓冲液，LB培养基

具体配制所需要的成分和用量在实验书上均有，需要在比例和一些操作上多加注意。

1）NGM普通固体平板每组需要配制500ml（实际上配少了），其中的细菌蛋白胨为peptone。

胆固醇以及磷酸钾缓冲液要在其他组分混合并且高温灭菌之后加入，统一倒平板，放置20h左右至表面干燥。

2）LB培养基中的胰蛋白酶冻是typtone，我们每组配制了500ml，121℃高压蒸汽灭菌。

3）Amp+为200mg/ltet+为100mg/lIPTG为1Mm,均需要抽滤之后放入离心管中。

4）第二大组配制LB培养基（Amp+tet+）NGM固体平板（Amp+）IPTG浓度为4mM。

2、大肠杆菌的培养

1）在NGM普通固体平板上划线培养大肠杆菌OP50

2）在NGM固体平板（Amp+tet+）上划线培养大肠杆菌HT115（对照组和实验组）

3、大肠杆菌的活化

1）大肠杆菌OP50的活化：

挑取少量的大肠杆菌OP50到LB普通液体培养基中，37℃振荡培养20h。

之后铺到NGM普通固体平板。

2）大肠杆菌HT115的活化：

挑取少量的大肠杆菌HT115（对照组和实验组）到LB培养基（Amp+tet+）中，37℃振荡培养20h。

3）大肠杆菌HT115的再活化：

吸取1mL的大肠杆菌HT115（对照组和实验组）到LB培养基（Amp+tet-）中，37℃振荡培养20h。

之后铺到NGM固体平板（Amp+tet+）上。

4、rrf-3突变体的培养：

将线虫rrf-3突变体接种到含有大肠杆菌OP50的NGM普通固体平板上，20℃培养。

5、线虫扩繁（用到chunck）

选择线虫rrf-3突变体培养基中未受到污染而且线虫长势较好的部分切下一小块（手术刀蘸酒精，酒精灯烧，重复三次），接到大肠杆菌OP50的NGM普通固体平板上。

20℃培养（由于线虫长势问题，培养了接近三天）

6、线虫生长周期的同步化

1）取3mL的M9缓冲液加入到线虫rrf-3突变体的NGM普通固体平板，反复轻轻地晃动平板，将平板上的线虫冲洗下来，然后将含有线虫的M9缓冲液转移到15mL的离心管中。

2）向离心管加入2mL的Naclo溶液和1mLNaOH（5mol/L）溶液，之后马上盖紧盖子剧烈晃动离心管。

当发现溶液中的线虫身体呈现弯曲状，并且还没有出现絮状物时，加入M9缓冲液至15mL以终止反应。

3000r/min离心1min。

3）弃上清，加M9缓冲液至15mL，3000r/min离心1min，重复。

4）弃上清，小心吹打沉淀，并将沉淀滴入未铺菌的NGM普通固体培养皿中央，20℃培养16-20小时。

7、收获L1幼虫及chunck

1）培养16-20h后，NGM平板上的线虫发育成L1幼虫。

取500uL的M9缓冲液冲洗平板中的线虫，并将冲洗下的L1幼虫放到1.5mL的离心管中。

将L1幼虫平均分为两份，分别接到大肠杆菌HT115（对照组和实验组）的平板中。

20℃培养。

2）将培养线虫的培养基选择无污染且线虫长势较好的部分切下来一小块，接到OP50平板上，对照组和实验组分别接1个大板，普通的小板两个（培养线虫留着做后续的实验的）。

8、Singleworm（挑单个虫）

睫毛依次蘸取Naclo、70%乙醇、无菌水/M9缓冲液，在显微镜下分别挑取实验组和对照组的线虫，分别放在两个含有OP50的NGM固体培养板上，每个平板里两只线虫（我们有的平板里会多挑取一只）。

9、观察RNAi的表型和效率

第二天在显微镜下观察并且对实验组和对照组平板内的卵进行计数。

4、实验结果

这是我们计数得到的结果

对照组

实验组

1

2

1

2

虫卵数

35

81

3

1

接虫数

2

3

2

2

虫卵数/接虫数

17.5

27

1.5

0.5

我将对照组和实验组的虫卵数/接虫数取了平均值，并运用EXCEL做成了柱状图进行明显的比较。

5、结果分析

从数据以及图标结果看来，对照组平均产卵比例远高于实验组的产卵比例，说明tag--214基因有控制线虫产卵的功能，当这种基因被沉默掉后，线虫的产卵率明显下降，另一方面也说明此次的RNA干扰实验做的比较成功，得到了与理论相一致的结果。

但是在实验过程中，我们也出现了一些问题，包括有平板的杂菌污染，最后得到的去做RT-PCR的菌也较少，所以，在下面，主要对这些细节错误以及过程中的注意事项进行分析：

1、在实验过程过需要配制的试剂以及其它溶液要根据配方和用量，按照一定比例配，在秉着不浪费的前提下可以多配制一些，以备不时之需。

2、在对大肠杆菌或者线虫进行培养或者操作的时候，一定要在超净台，而且不要通过其他方式造成污染。

在后面chunck的时候，由于好多平板上都被污染，干净的平板已经不够了，所以我们最后缺少的平板只能挑选污染最小用，这也给我们后来的实验造成了很大的干扰，因为污染并没有排除，而是越来越重，导致培养的线虫不能用。

3、冲洗L1幼虫并分板培养的时候，尽量把幼虫的量平分，否则有的板长出来的虫多，有的少，而我们虫多的平板被污染了，所以后面RT-PCR的线虫是使用老师提供的线虫进行的实验。

4、在挑取线虫的时候，睫毛要按照顺序依次蘸取Naclo、70%乙醇、无菌水/M9缓冲液，顺序不要错也不要落下，最后在计数的时候可以选择在平板表面进行十字划线计数法，这样计数可以简单方便一些。

RNA的提取、鉴定以及RT-PCR

1、实验背景

1、RNA的制备是通过cDNA途径克隆目的基因，了解基因在不同的组织或细胞中的表达水平，以及研究基因转录调控等必不可少的实验技术。

RT-PCR是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链扩增相结合的技术。

2、本次试验利用Trizol法提取RNA，Trizol的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可以裂解细胞，促进核蛋白体的解离，并将RNA释放到溶液中；苯酚会使蛋白质变性，加入氯仿后可抽提苯酚，促使RNA进入水相。

3、RNA是一类极易被降解的分子，因此要得到完整的RNA必须要最大限度的抑制提取过程中内源或者外源的RNA酶活性。

提纯得到的RNA可以使用非变性和变性凝胶电泳进行检测。

非变性RNA凝胶电泳可避免使用有毒的物品，但是由于RNA分子相互作用形成大量的双链结构，故无法判断RNA的相对分子质量。

在完全变性的条件下，RNA分子完全伸展，其电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。

因此要测定RNA分子相对分子质量时，一定要用变性凝胶。

4、在总RNA分子中以rRNA最多，占80%-85%，完整为降解的RNA分子的电泳图谱可以清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三条带。

如果28s和18s条带明亮，条带边缘清晰，且28s条带的亮度是18s条带的两倍以上，则认为RNA没有被降解。

经过鉴定未降解的RNA分子可通过RT-PCR反应对某一特定的基因进行扩增。

RT-PCR反应由两部分组成，首先是以RNA为模板合成cDNA，然后以cDNA为模板通过PCR扩增目的片段。

用于逆转录的引物有随机引物、OligodT以及基因特异性引物。

OligodT适合具有polyA尾巴的RNA，不能用于原核生物的RNA，真核生物的rRNA和tRNA等。

5、本实验的目的是以线虫为实验材料，通过提取总RNA，利用RT-PCR技术扩增线虫的acting基因的片段，学习并掌握RNA提取和鉴定，以及RT-PCR反应的基本原理和实验技术。

2、实验材料与试剂

1、实验材料：

秀丽隐杆线虫野生型N2

2、实验试剂：

Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、琼脂糖、DNA上样缓冲液、RT试剂盒，PremixTap酶。

3、实验操作

1）RNA分子的提取

1、2mLM9溶液1500r/min，离心1min收集线虫；将虫体转移到无RNA酶的研钵中，加入液氮研磨。

其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。

2.收集研磨的粉末，按50~100mg组织/mLTrizol加入Trizol，室温静置5min。

3.12,000r/min4℃离心10min。

4.小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。

5.加入氯仿（200µl氯仿/mLTrizol），盖紧管盖，用力震荡15秒，再室温静置3min。

6.12,000r/min4℃离心10min。

7.从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中。

8.向上清中加入异丙醇（500µL异丙醇/mLTrizol），上下颠倒充分混匀后，室温静置10min。

9.12,000r/min4℃离心10min。

10.小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇lmL，轻轻上下颠倒离心管，12,000r/min4℃离心5min后，小心弃去乙醇。

11.室温干燥沉淀2～5min后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

12.待RNA沉淀完全溶解后进行RT-PCR反应。

2）通过甲醛变性凝胶电泳鉴定提取的RNA

这一部分是老师为我们完成的，具体的操作步骤就是按照ppt上的来看的。

1.将电泳槽和制胶用具在0.3%H2O2中浸泡30min，取出后用DEPC水冲洗并晾干。

然后用75%乙醇冲冼一遍，晾干备用。

2．配制琼脂糖凝胶：

（1）称取0.5g琼脂糖，置干净的100mL锥形瓶中，加入36mLDEPC水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。

（2）胶冷却至60~70℃后，依次向其中加入9mL甲醛、5mL10MOPS缓冲液和3μL溴化乙锭（1g/L），混合均匀。

（3）倒入已放置好梳齿的胶板内，于室温放置30min以上使凝胶凝固。

凝胶凝固后，小心取出梳齿，将胶放入电泳槽中，加入1×MOPS缓冲液使凝胶刚好浸没。

3．样品准备：

（1）取DEPC处理过的500μL小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μL、甲醛3.5μL、甲酰胺（去离子）10μL、RNA样品4.5μL，混匀。

（2）将离心管置于60℃水浴中保温10min，再置冰上2min。

（3）向管中加入3μL上样缓冲液，混匀。

4．上样：

将上述处理好的样品依次加入凝胶的各加样孔中。

5．电泳：

将样品加入加样孔后，以3~4V/cm电压降电泳，当溴酚兰移动到胶的3/4处停止电泳。

6．检测和分析：

电泳结束后，在紫外灯下检查结果。

3）RT-PCR反应

1.逆转录RT反应

（1）取3µgRNA，2µgOligodT至eppendorf管中，70℃10min，高速离心5sec后置于冰上，目的是打开RNA的二级结构；

（2）按下列顺序在一新管中加入以下试剂（20µL体系）：

MgCl2（25mmol/L）2.4µL

5×ReverseTranscriptionbuffer4.0µL

dNTPmixture（10mmmol/L）1.0µL

RecombinantRNasinRibonuCleaseinhibitor1.0µL

AMVReverseTranscriptase25U/µL0.6µL（15U）

RNA1µg

用RNase-freeddH2O补足至20µL

（3）反应过程：

25℃5min,42℃1h,70℃15min,4℃放置继续或者—20℃保存。

2.PCR反应（反应体系为25uL）

PremixExTaq12.5µL

Sense引物（10µM）1µL

Antisense引物（10µM）1µL

cDNA5uL（稀释5倍）

用ddH2O补足体积至25µL

PCR反应条件为：

94℃1min

94℃30sec

55℃1min

72℃30sec（从94℃30sec至此步骤重复30次）

72℃5min

3.DNA琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR实验结果。

4、实验结果及分析

本次实验结果主要是根据RNA和DNA电泳结果来判断成功与否的。

所以在接下来附上电泳结果。

电泳结果图：

1、RNA甲醛变性凝胶电泳鉴定图

2、DNA琼脂糖凝胶电泳检测图

5、实验结果分析

1）RNA甲醛变性凝胶电泳鉴定图

在电泳图中与MAKER条带对比可以发现三条条带，由远及近分别为18srRNA、18srRNA、5srRNA。

其中，5srRNA含量少，所以条带较暗，很不清楚；18srRNA、28srRNA条带均很亮，条带边缘比较清晰，而且28srRNA条带的亮度可以达到18srRNA条带亮度的2倍，说明我们组提取的RNA没有被降解。

但是在上样孔处有一条暗暗的条带，查阅资料说，上样孔处如果有条带，说明有DNA污染。

整个组基本上都存在或明或暗的条带，但是从后面的结果来看，其他大多数组都没什么影响，只有我们组出现了一条杂带，所以，我认为，少量的DNA污染对实验结果的影响较小。

不过，不能排除影响的存在，所以在RNA沉淀以及沉淀分离的过程中一定要多加注意，要把上清弃的干净些，否则稍有的才能留可能会造成很大的影响。

2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测图

我们是第一大组第四小组，从最后的实验结果来看，我们组确实获取到了RNA，逆转录得到了cDNA,因此也在PCR之后扩增得到了Acting的基因片段。

但是，唯一的缺憾是，我们的电泳条带中竟然多出了一条较清晰明亮的杂带，第3小组也有，但是亮度很暗，我也看了第二大组的结果，未出现相同的状况。

通过在网上查阅资料，分析在该过程中出现杂带的原因：

1、内参引物的特异性不好，可能是非特异性扩增导致。

2、反转的cDNA里面含有较多的基因组DNA，可能是RNA提取质量不到位导致，碰巧这对内参引物横跨了内含子，从而导致PCR出现2条带。

加上之前RNA点用的结果，整体分析，我觉得出现杂带的原因是之前RNA提取的不到位，含有少量的DNA，在整个过程中，大家所添加的引物都是相同的，所以，应该不会产生非特异性扩增，在之前的RNA电泳结果中，我们组的上样孔处有杂带，是有DNA污染的迹象。

不过，其他组的RNA电泳结果也存在DNA污染，最终的DNA电泳结果却未出现杂带，排除宏观因素，如果是在我们添加引物的时候我们出现问题，添加过少、之后未被混匀等的因素，也是有可能。

6、实验注意事项

1、由于RNA酶是极易被降解的，所以整个过程一定要带手套和口罩。

而且用试剂的时候一定要仔细看好了，在添加的时候一定要添加去RNA酶的等经过处理的。

2、在加入异丙醇沉淀RNA要混匀，使RNA充分沉淀，弃上清，要干净，再加入乙醇后，也要充分混匀并将上清弃的干净，否则若残留DNA，对后面实验的会产生影响。

3、提取到的RNA要待RNA沉淀完全溶解后再进行RT-PCR反应。

4、其余步骤主要按照实验书和老师授课的认真做。

7、思考题

1、如何防止提取过程中RNA的降解？

1）尽量避开RNA专用操作区，离心机、移液器、试剂等均专用，并保持清洁。

2）操作过程中应始终戴一次性PE手套，并经常更换，戴口罩避免交谈。

3）尽量使用一次性已去除RNA酶的塑料制品、吸头、离心管等以防交叉感染。

4）配制用的酒精、异丙醇、TRIS等应采用未开封的新瓶。

5）玻璃和金属器皿需要180℃干烤6-8h。

2、提取的RNA有什么应用？

1）逆转录形成cDNA，PCR扩增后可用于基因工程。

2）成为dsRNA，用于RNA干扰技术。

3、确定RNA质量的方法有几种？

1）检测RNA溶液的吸光值

A260/280=2时为纯的RNA

A260/280=1.8时为双链DNA

A260/280>2.2,时RNA已水解为单核酸

2）RNA电泳图谱：

变性凝胶电泳，与Maker进行对比。