RNA提取及组织匀浆.docx
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RNA提取及组织匀浆.docx
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RNA提取及组织匀浆
1、取组织块(0.2g~1g)最少可到2~5mg,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,放入5或10ml的小烧杯内
2、2、用移液管量取预冷的匀浆介质(ph7.4,0.01mol/LTris-HCL,0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化钠溶液)或者用0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天然时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织的小烧杯放入冰水中)。
3、3、匀浆的方式有多种:
手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融。
4、手工匀浆:
将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。
5、机器匀浆:
用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
6、超声粉碎:
用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次。
7、反复冻融:
培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆,也可以反复冻溶3次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解,反复3次左右),但有部分酶活力会受影响。
8、取少量组织匀浆做涂片(直接涂片、染色均可),显微镜下观察细胞是否磨破,若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。
9、4、将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心10~15分钟,若检测ATP酶,则只需要1000转/分,离心5分钟,将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。
10、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种测定
TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品(50~100mg组织、5×106细胞)也适用于大量样品(≥1g组织、>107细胞)。
对人,动物,植物组织,细菌均适用,可同时处理大量不同样品,整个提取过程在一小时内即可完成。
分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于NorthernBlot,dotblot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品,避免出现假阳性。
共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。
蛋白质可用于WesternBlotting。
规格:
100ml黄色透明液体
储存条件:
2~8℃避光保存12个月
注意:
请勿直接接触皮肤或吞咽,以免灼伤。
如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
忌用乙醇擦洗,乙醇会加重灼伤程度。
预防RNase污染注意事项:
1.经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。
2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,高压灭菌,即可去除RNase。
4.配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌
注:
DEPC有致癌之嫌,需小心操作)。
RNA的提取
1.匀浆处理:
a.组织将组织在液氮中磨碎,每50~100mg组织加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。
TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。
TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液离心收集细胞,每5~10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol,反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2.将匀浆样品在室温(15~30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:
如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2~8℃10000×g离心10分钟,取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。
处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
5.2-8℃10000×g离心15分钟。
样品分为三层:
底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
6.把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。
用异丙醇沉淀水相中的RNA。
每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
7.2~8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
移去上清。
8.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。
每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。
2~8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。
9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5~10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。
加入25~200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55~60℃放置10分钟使RNA溶解。
如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。
RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。
注意事项:
1.从少量样品(1~10mg组织或102~104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。
例如加800mlTRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5~10μgRNase-free糖原。
糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。
2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。
RNA沉淀可以保存于75%酒精中2~8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600×g离心30~60分钟。
预期产量:
1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为:
肝和脾6~10μg,肾3~4μg,骨骼肌和脑组织1~1.5μg,胎盘1~4μg,上皮细胞8~15μg,成纤维细胞5~7μg。
常见问题分析:
得率低:
A.样品裂解或匀浆处理不彻底。
B.RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65:
A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。
低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。
B.样品匀浆时加的试剂量太少。
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。
D.吸取水相时混入了有机相。
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解:
A.组织取出后没有马上处理或冷冻。
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃。
C.细胞在用胰酶处理时过度。
D.溶液或离心管未经RNase去除处理。
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。
DNA污染:
A.样品匀浆时加的试剂量太少。
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液。
蛋白聚糖和多糖污染:
沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。
这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。
从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。
DNA的分离
准备试剂:
乙醇0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)75%乙醇8mMNaOH
操作步骤:
1.样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。
每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2~8℃不超过2000×g离心5分钟。
2.移去上清,(如需分离蛋白质,可保留,进一步操作见后)用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。
每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,2~8℃2000×g离心5分钟,弃上清,重复一次。
3.用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每用1mlTRIzol加入1.5~2ml75%乙醇,室温放置10~20分钟(不时颠倒混合)2~8℃2000×g离心5分钟,弃上清。
4.室温放置晾干DNA5~15分钟,用8mMNaOH溶解DNA。
从50~70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300~600μl8mMNaOH,DNA的浓度通常为0.2~0.3μg/μl。
提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中,建议用弱碱溶解,8mMNaOH的pH值为9,溶解DNA后可用TE,HEPES调节pH。
从某些样品(尤其是组织)中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。
DNA的定量:
取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。
一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。
根据DNA产量可估计细胞数,人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。
预期产量:
1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3~4μg骨骼肌,脑组织,胎盘2~3μg人,大鼠,小鼠培养细胞(1×106)5~7μg成纤维细胞5~7μg。
应用:
1.用于PCR溶于8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES调pH至8.4,取0.1~1μgDNA用作模板。
2.酶切反应用HEPES或1mMEDTA调节pH至适当值。
每μgDNA使用3~5单位的酶,80~90%的DNA是可消化的。
1ml8mMNaOH溶解的DNA样品pH值调节
FinalpH0.1MHEPES(μl)FinalpH1MHEPES(μl)
8.4867.223
8.2937.032
8.0101
7.8117
7.5159
注意事项:
1.DNA在中间层和有机相中时可在2~8℃保存过夜。
2.DNA沉淀在75%乙醇中2~8℃可保存几个月。
3.DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置过夜,如长期保存需用HEPES调节pH至7~8并且加EDTA至1mM,可置于4℃或-20℃长期保存。
常见问题分析:
得率低:
A.样品匀浆和裂解的不彻底。
B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。
A260/A280<1.70:
A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。
B.酚除去的不彻底,可用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解:
A.组织取出后没有马上处理或冷冻。
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃。
C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪。
RNA污染:
A.氯仿分层后水相去除的不干净。
B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)洗的不彻底。
蛋白质的提取
准备试剂:
异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。
操作步骤:
1.取沉淀DNA后剩余的上清,用异丙醇沉淀蛋白质。
每使用1mlTRIzol加1.5ml异丙醇,室温放置10分钟,2~8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。
每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液,室温放置20分钟,2~8℃7500×g离心5分钟,弃上清,重复两次。
用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白质沉淀5~10分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃温浴使其完全溶解,不溶物2~8℃10000×g离心10分钟除去。
分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或-5至-20℃保存备用。
注意事项:
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2~8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
2.用0.1%SDS在2~8℃透析三次,10000×g离心10分钟取上清即可用于WesternBlot。
常见问题分析:
得率低:
A.样品裂解或匀浆处理不彻底。
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。
蛋白质降解:
组织取出后没有马上处理或冷冻。
电泳时条带变形:
蛋白质沉淀洗涤不充分。
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