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生物工程下游技术
第一章绪论
★什么是生物工程的下游技术?
生物工程的下游技术:
一般泛指从工程菌或工程细胞的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量检测所需要的一系列单元操作技术。
其中,产品的分离纯化是其最重要的组成部分。
2.生物工程下游技术的发展历程?
1.古代酿造业生物技术产业的历史可追溯到古代的酿造业,它包括酿酒、制酱(油)、醋、酸奶和干酪等。
2.第一代生物技术主要指19世纪60年代到20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。
这一时期,发现了发酵的本质是微生物的作用,掌握了纯种培养技术,生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。
此时开始引入化学工程中成熟的近代分离技术,如过滤、蒸馏、精馏等。
3.第二代生物技术以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。
产品品种、类型迅速增加,不仅有初级代谢产物,也有次级代谢产物;不仅有小分子的物质,也有具生命活性的大分子物质,有些产品的分子结构相当复杂。
4.第三代生物技术一般认为以20世纪70年代末掘起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。
此时,生物技术在其主要领域:
基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程取得了长足进步,一批对人类十分有益的高附加值的产品开始面世,如乙肝疫苗、干扰素等。
★3.细胞破碎技术?
初步分离纯化技术?
高度分离纯化技术?
细胞破碎是工业化生产胞内物质所必需的技术,已经开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。
主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。
较早出现的是酶及蛋白质的盐析法;有机溶剂沉淀法;双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离,为进一步纯化精制创造了前提;超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题,在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。
小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。
生物大分子的纯化一直是个难题。
70年代以来,逐渐开发出各种色谱(层析)技术,如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等,后两种技术已开始用于批量生产。
★4、下游技术的一般工艺过程?
按生产过程划分,生物工程下游技术大致可分为4个阶段,即预处理、提取(初步分离)、精制(高度纯化)、成品制作。
如下图所示。
发酵液预处理细胞分离细胞破碎碎片分离提取精制成品制作
加热过滤匀浆法离心沉淀(重)结晶浓缩
调pH离心研磨法双水相吸附离子交换干燥
絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌过滤
超滤膜分离成型
结晶
图1-1生物工业下游技术一般工艺过程
★5、什么是生物工程下游技术永久性的发展方向和推动力?
成本、质量、环境保护将是生物工程下游技术永久性的发展方向和推动力。
★6、清洁生产(CleanerProduction)?
清洁生产:
将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中,以期减少对人类和环境的风险。
它包括三方面内容:
即清洁生产工艺(技术)、清洁产品、清洁能源。
清洁生产工艺是生产全过程控制工艺,包括节约原材料和能源,淘汰有毒害的原材料,并在全部排放物和废物离开生产过程以前,尽最大可能减少它们的排放量和毒性,对必须排放的污染物实行综合利用,使废物资源化。
第二章发酵液预处理
★1.发酵液有什么特性?
微生物发酵液的特性可归纳为:
①发酵产物浓度较低,大多为1%~10%,悬浮液中大部分是水;
②悬浮物颗粒小,相对密度与液相相差不大;
③固体粒子可压缩性大;
④液相粘度大,大多为非牛顿型流体;
⑤性质不稳定,随时间变化,如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。
★2、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些?
其简要机理如何?
一、降低液体粘度
根据流体力学原理,滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比,可见降低液体粘度可有效提高过滤速率。
降低液体粘度的常用方法有加水稀释法和加热法等。
采用加水稀释法虽能降低液体粘度,但会增加悬浮液的体积,加大后继过程的处理任务。
而且,单从过滤操作看,稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效,即若加水一倍,则稀释后液体的粘度必须下降50%以上才能有效提高过滤速率。
升高温度可有效降低液体粘度,提高过滤速率,如12°Be麦芽汁40℃时粘度为1.2X10-3Pa·s,升高至75℃其粘度可下降一半,过滤速率可加倍1倍。
同时,在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚,形成较大颗粒的凝聚物,进一步改善了发酵液的过滤特性。
如链霉素发酵液,调酸至pH3.0后,加热至70℃,维持半小时,液相粘度下降至1/6,过滤速率可增大:
10~100倍。
使用加热法时必须严格控制加热温度与时间。
首先,加热的温度必须控制在不影响目的产物活性变质的范围内;其次,温度过高或时间过长,会使细胞溶解,胞内物质外溢,增加发酵液的复杂性,影响其后的产物分离与纯化。
二、调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,适当调节pH值可改善其过滤特性。
此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。
对于蛋白质,由于羧基的电离度比氨基大,故蛋白质的酸性性质通常强于碱性,因而大多数蛋白质的等电点都在酸性范围内(pH4.0~5.5)。
利用酸性来调节发酵液pH值使之达到等电点,可除去蛋白质等酸性两性物质。
在膜过滤中,发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附,通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质,即可减少堵塞和污染。
此外,细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒,有利于过滤的进行。
三、凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态,使其聚结成较大的颗粒,便于提高过滤速率。
除此之外,还能有效地除去杂蛋白质和固体杂质,提高滤液质量。
因此,凝聚和絮凝是目前工业上最常用的预处理方法之一。
凝聚是指在电解质作用下,由于胶粒之间双电层电排斥作用降低,电位下降,而使胶体体系不稳定的现象。
絮凝则是指在某些高分子絮凝剂存在下,基于桥架作用,使胶粒形成较大絮凝团的过程。
1、凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面,一般都带有电荷,带电的原因很多,主要是吸附溶液中的离子和自身基团的电离。
在生理pH值下,发酵液中的菌体或蛋白质常常有负电荷,由于静电引力的作用,使溶液中带相反电荷的阳离子被吸附在其周围,在界面上形成双电层。
这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
双电层的电位越高,电排斥作用越强,胶体粒子的分散程度也就越大,发酵液过滤就越困难。
根据Schuze-Hardy法则,反离子的价数越高,凝聚值就越小,即凝聚能力越强。
阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为:
Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。
常用的凝聚电解质有硫酸铝Al2(SO4)3·18H20(明矾)、氯化铝AlCl3·6H20、三氯化铁FeCl3·6H20、硫酸亚铁FeSO4·7H20、石灰、ZnSO4、MgC03等。
2、絮凝
采用凝聚方法得到的凝聚体,其颗粒常常是比较细小的,有时还不能有效地进行分离。
采用絮凝法则常可形成粗大的絮凝体,使发酵液较易分离。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物,其相对分子质量可高达数万至一千万以上,它们具有长链状结构,其链节上含有许多活性官能团,包括带电荷的阴离子(如-COOH)或阳离子(如-NH2)基团以及不带电荷的非离子型基团。
它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用,强烈地吸附在胶粒的表面。
当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上,产生桥架联接时,就形成了较大的絮团,这就是絮凝作用。
对絮凝剂的化学结构一般有下列两方面的要求,一方面要求其分子必须含有相当多的活性官能团,使之能和胶粒表面相结合;另一方面要求必须具有长链的线性结构,以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团,但相对分子质量不能超过一定限度,以使其具有良好的溶解性。
根据其活性基团在水中解离情况的不同,絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。
根据其来源的不同,工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类:
(1)有机高分子聚合物,如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物。
(2)无机高分子聚合物,如聚合铝盐、聚合铁盐等。
(3)天然有机高分子絮凝剂,如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
目前最常用的絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)类衍生物,其絮凝体粗大,分离效果好,絮凝速度快,用量少(一般以mg/L计),适用范围广。
它们的主要缺点是存在一定的毒性,特别是阳离子型聚丙烯酰胺,一般不宜用于食品及医药工业。
近年来发展的聚丙烯酸类阴离子絮凝剂,无毒,可用于食品和医药工业。
絮凝效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。
同时,在絮凝过程中,常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。
溶液pH值的变化常会影响离子型絮凝剂中官能团的电离度,从而影响吸附作用的强弱。
3、混凝
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说,采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理,所以可以单独使用。
对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂,则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附桥架,所以它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用。
首先加入电解质,使悬浮粒子间的双电层电位降低、脱稳,凝聚成微粒,然后再加入絮凝剂絮凝成较大的颗粒。
无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件,从而大大提高了絮凝的效果。
这种包括凝聚和絮凝机理的过程,称为混凝。
四、加入助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒,它能使滤饼疏松,滤速增大。
这是因为使用助滤剂后,悬浮液中大量的细微胶体离子被吸附到助滤剂的表面上,从而改变了滤饼结构,它的可压缩性下降了,过滤阻力降低了。
常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等,其中最常用的是硅藻土。
助滤剂的使用方法有两种:
一种是在过滤介质表面预涂助滤剂,另一种是直接加入发酵液,也可两种方法同时兼用。
对于第二种使用方法,使用时需要一个带搅拌器的混合槽,充分搅拌混合均匀,防止分层沉淀。
除此之外,选择和使用助滤剂的要点如下:
(1)根据目的产物选择助滤剂品种
(2)根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种
(3)粒度选择
(4)使用量的选择
五、加入反应剂
加入某些不影响目的产物的反应剂,可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响,从而提高过滤速率。
加入反应剂和某此可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,如CaSO4、AlPO4等。
生成的沉淀能防止菌丝体粘结,使菌丝具有块状结构,沉淀本身可作为助滤剂,并且能使胶状物和悬浮物凝固,从而改善过滤性能。
如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠,生成的磷酸钙沉淀可充当助滤剂,另一方面可使某些蛋白质凝固。
又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理,生成磷酸钙沉淀,能使悬浮物凝固,多余的磷酸根离子还能除去钙、镁离子,并且在发酵液中不会引入其他阳离子,以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。
正确选择反应剂和反应条件,能使过滤速率提高3~10倍。
如发酵液中含有不溶性多糖物质,则最好用酶将它转化为单糖,以提高过滤速率。
例如万古霉素用淀粉作培养基,发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶,搅拌30min后,再加2.5%硅藻土助滤剂,从而可使过滤速率提高5倍。
★3、什么是等电点?
等电点沉淀法?
对于氨基酸、蛋白质等两性物质,在酸性条件下带正电荷,在碱性条件下带负电荷,而在某一pH值下,净电荷为零,称为等电点。
在等电点下,两性物质的溶解度最小,此即为等电点沉淀法。
4.凝聚与絮凝的区别?
v凝聚是指在电解质作用下,由于胶粒之间双电层电排斥作用降低,电位下降,而使胶体体系不稳定的现象。
凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质,在电解质中异电离子作用下,胶粒的双电层电位降低,使胶体体系不稳定,胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。
电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示,使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度(mmol/L)称为凝聚值。
根据Schuze-Hardy法则,反离子的价数越高,凝聚值就越小,即凝聚能力越强。
阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为:
Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。
常用的凝聚电解质有硫酸铝Al2(SO4)3·18H20(明矾)、氯化铝AlCl3·6H20、三氯化铁FeCl3·6H20、硫酸亚铁FeSO4·7H20、石灰、ZnSO4、MgC03等。
v絮凝则是指在某些高分子絮凝剂存在下,基于桥架作用,使胶粒形成较大絮凝团的过程。
v采用凝聚方法得到的凝聚体,其颗粒常常是比较细小的,有时还不能有效地进行分离。
采用絮凝法则常可形成粗大的絮凝体,使发酵液较易分离。
v絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物,其相对分子质量可高达数万至一千万以上,它们具有长链状结构,其链节上含有许多活性官能团,包括带电荷的阴离子(如-COOH)或阳离子(如-NH2)基团以及不带电荷的非离子型基团。
它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用,强烈地吸附在胶粒的表面。
当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上,产生桥架联接时,就形成了较大的絮团,这就是絮凝作用。
对絮凝剂的化学结构一般有下列两方面的要求,一方面要求其分子必须含有相当多的活性官能团,使之能和胶粒表面相结合;另一方面要求必须具有长链的线性结构,以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团,但相对分子质量不能超过一定限度,以使其具有良好的溶解性。
根据其活性基团在水中解离情况的不同,絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。
根据其来源的不同,工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类:
v
(1)有机高分子聚合物,如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物。
v
(2)无机高分子聚合物,如聚合铝盐、聚合铁盐等。
v(3)天然有机高分子絮凝剂,如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
目前最常用的絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)类衍生物,其絮凝体粗大,分离效果好,絮凝速度快,用量少(一般以mg/L计),适用范围广。
它们的主要缺点是存在一定的毒性,特别是阳离子型聚丙烯酰胺,一般不宜用于食品及医药工业。
近年来发展的聚丙烯酸类阴离子絮凝剂,无毒,可用于食品和医药工业。
絮凝效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。
同时,在絮凝过程中,常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。
溶液pH值的变化常会影响离子型絮凝剂中官能团的电离度,从而影响吸附作用的强弱。
絮凝剂的最适添加量往往需通过试验确定,虽然较多的絮凝剂有助于增加桥架的数量,但过多的添加量反而会引起吸附饱和,絮凝剂争夺胶粒而使絮疑团的粒径变小,絮凝效果下降。
5.如何除去发酵液中的杂蛋白质?
v
(1)沉淀法
v蛋白质是两性物质,在酸性溶液中,能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀;在碱性溶液中,能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。
v
(2)变性法
v蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性,变性蛋白质的溶解度较小。
使蛋白质变性的方法很多,其中最常用的是加热法。
加热不仅使蛋白质变性,同时降低液体粘度,提高过滤速率。
例如,将柠檬酸发酵液加热至80℃以上,使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度,即可大大提高过滤速率。
使蛋白质变性的其他方法有:
大幅度调节pH,加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
如在抗生素生产中,常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH2~3)或较碱性范围(pH8~9)使蛋白质凝固,一般以酸性下除去的蛋白质较多。
变性法存在一定的局限性。
如加热法只适合于对热较稳定的目的产物;极端pH也会导致某些目的产物失活,并且要消耗大量酸碱;而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。
(3)吸附法
v加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。
例如在四环类抗生素中,采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN6)]2的胶状沉淀来吸附蛋白质,在生产实际中已取得很好的效果。
在枯草芽孢杆菌发酵液中,加入氯化钙和磷酸氢二钠,两者生成庞大的凝胶,把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去,从而可加快过滤速率。
第三章细胞破碎、蛋白质复性和固液分离
★1.常用的细胞破碎方法?
1、高压匀浆法
高压匀浆法所用设备是高压匀浆器(Highpressurehomogenizer),最早用于牛奶的匀浆化,使奶质均匀,不产生分层、成膜现象。
(1)作用机理从高压室(几十兆帕)压出的细胞悬浮液(见图5-2)经过阀座3的中心孔道从阀座3和阀杆5之间的小环隙中喷出,速度可达几百米每秒。
这种高速喷出的浆液又射到静止的碰撞环4上,被迫改变方向从出口管流出。
细胞在这一系列过程中经历了高流速下的剪切、碰撞以及由高压倒常压(出口处压力)的变化,使细胞产生较大的形变,导致细胞壁的破坏。
细胞壁是细胞的机械屏障,稍有破坏就会造成细胞膜的破坏,胞内物质在渗透压作用下释放出来,从而造成细胞的完全破坏。
细胞悬浮液经过一次高压匀浆后,常常只有一部分细胞破碎,不能达到100%的细胞破碎率。
为此,需要在收集完破碎液(通常称为“细胞匀浆”)后进行第二次、第三次或更多次的破碎,这是高压匀浆法的缺点。
为避免操作烦琐,也可以将细胞匀浆进行循环破碎,但要避免过度破碎带来产物的损失,以及细胞碎片进一步变小,影响后面对碎片的分离。
(2)动力学方程值得提出的是在细胞破碎过程中,胞内物质的释放快慢由内含物在胞内的位置决定。
例如,胞间质(periplasm)的释出先于胞内质(cytoplasm),而膜结合酶(membrane-boundenzyme)最难释放。
(3)温控与能耗人们普遍关心的是活性物质在破碎过程中的失活问题,研究表明蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。
如果能将温度控制在35℃以下,那么酶活损失可以忽略。
对于温度敏感性物质低温操作是必需的。
高压匀浆一般需多级操作,每次循环前往往进行级间冷却。
尽管提高压力有利于细胞破碎,但是提高压力需增加能耗(3.5kW/100MPa),同时为移走产生的热量(23.8℃/100Mpa)需要付出代价。
机械破碎的能耗主要包括提供动力(如压力)消耗的能量以及低温操作耗费的能量。
(4)存在的问题除了较易造成堵塞的团状或丝状真菌以及较小的革兰阳性菌不适合用高压匀浆器处理以外,其他微生物细胞都可以用高压匀浆法破碎。
另外有些亚细胞器(如包含体,inclusionbody)质地坚硬,易损伤匀浆阀,也不适合用该法处理。
但也有人在实验室用高压匀浆器研究真菌和含有包含体的大肠杆菌的破碎。
2、高速珠磨法
(1)作用机理微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂(通常是d<1mm的无铅玻璃珠)在搅拌桨作用下充分混合,珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞,促使细胞壁破裂,释出内含物。
在珠液分离器的协助下,珠子被滞留在破碎室内,浆液流出,从而实现连续操作。
破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。
(2)动力学方程微生物细胞的形态和生理因素决定了细胞壁的化学组成与机械强度,从而决定了细胞破碎的难易程度。
显然这些复杂的因素难以用简单的方程来描述,只能通过实验加以区分比较。
(3)温控和能耗珠磨机是采用夹套冷却的方式实现温度控制的,一般情况下能够将温度控制在要求的范围内。
珠磨机破碎的能耗与细胞破碎率成正比。
提高破碎率,需要增加装珠量,或延长破碎时间,或提高转速,这些措施不仅导致电能消耗的增加,而且产生较多的热量,引起浆液温度升高,从而增加了制冷费,因此总能量消耗增加。
不仅仅如此,高破碎率还给后分离带来麻烦。
对于可溶性胞内产物的提取,细胞破碎后必须进行固-液分离,将细胞碎片除去。
尽管采用高速离心,错流微孔过滤,或双水相萃取等技术可以除去碎片,但是破碎率越高,碎片越细小,清除碎片越困难,并且不得不考虑产物活性损失因此增加的可能性。
总之,不管是高压匀浆,还是珠磨机破碎,都不是以破碎率为基准的,而考虑产物的收率和兼顾上下游过程。
(4)两种方式的比较(高压匀浆法同高速珠破法相比)高压匀浆法与高速珠磨法相比各有特点,前者操作参数少,易于确定,后者操作参数多,一般凭经验估计,并且玻璃珠之间的液体损失使一次处理85ml悬浮液最终只能得到50ml左右得浆液。
连续操作时珠磨机兼具破碎和冷却双重功能,减少了产物失活的可能性,而高压匀浆器配备换热器进行级间冷却;其次珠磨机法破碎在适当条件下一次操作就能达到较高的破碎率,而高压匀浆往往需循环2~4次才行;再者几乎所有种类的微生物细胞都可以用珠磨机破碎,包括含有包含体的基因工程菌的破壁。
3、超声破碎(ultrasonication)
(1)作用机理
可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。
声频高于15~20kHz的超声波在高强度声能输入可以进行细胞破碎,其破碎机理尚未弄清楚,可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。
空化现象是在强声波作用下,让气泡形成,胀大和破碎的现象。
超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。
采用超声破碎法处理少量样品时操作简便,液量损失少,因而在实验室规模应用较为普遍。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升,操作时常在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却及进行冷却。
但在大规模操作中,声能传递和散热均有困难。
此外,超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活,因而有一定的局限性。
(2)动力学方程
(3)存在的问题超声破碎在实验室规模应用较普遍,处理少量样品时操作简便,液量损失少;但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感活性物质变性失活,噪声令人难以忍受,而且大容量装置声能传递,散热均有困难,因而超声破碎的应用潜力有限。
4、化学渗透法
指某些化学药品可以改变细胞壁或膜的通透性,从而使内含物有选择地渗透出来的处理方式。
(1)作用机理化学渗透取决于化学试剂的类型及细胞壁和膜的结构与组成,表5-2列出不同类型微生物细胞的结构和化学组成。
各种化学试剂不同种类细胞作用的情况见表-3所示。
不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。
①EDTA作为螯合剂,可用于处理革兰阴性菌(如E.coli)对细胞的外层膜有破坏作用。
②有机溶剂常用甲苯,它能溶解细胞膜的磷脂层。
③TritonX-100是非离子型清洁剂,对疏水性物质具有很强的亲和力,能结合并溶解磷脂,因此起作用部位主要是内膜的双磷脂层。
化学渗透法以前主要用来检测胞内酶活性。
经化学试剂处理后,检测酶活性的底物等小分子可以渗透到胞内,这样就不必释出胞内酶了。
盐酸胍不仅能改变细胞的通透性,而且能溶解不溶性重组蛋白(如包含体),并在其他试剂的配合下使其二硫键断裂,变性解离成亚基,从而释放出来。
除去变性剂和杂蛋白后,在一定条件下恢复太链或肽链间的二硫键,再折叠复性成具有活性的蛋白质立体结构。
(2)优缺点
化学渗透法与机械法相比具有如下优点。
①对产物释出具有一定的选择性。
化学试剂处理能使一些分子量小的溶质(如多肽和小分子的酶蛋白)透过,而分子量大的物质(如核酸)则被阻滞在胞内。
②细胞外形保持完整;碎片少,有利于后分离。
③核酸释出量少,浆液粘度低,易于固液分离和进一步提取。
化学渗透法也有自身的缺陷。
①时间长,效率低。
一般胞内物质释放率不超过50%,而处理时间则长达2h以上,所以往往需添加还原剂(如巯基乙醇)作保护,以防活性损失太多。
②化学试剂具有毒性。
有些化学试剂本身就有较强的毒性,同时对产物也有毒害作用,进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂。
③通用性差
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