甘草酸二铵原料药质量研究资料10.docx
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甘草酸二铵原料药质量研究资料10.docx
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甘草酸二铵原料药质量研究资料10
甘草酸二铵原料药-质量研究资料10
10、质量研究工作的试验资料及文献资料一、样品
本公司试制的甘草酸二铵原料药三批:
批号为。
批量分别为804g,799g,802g。
二、含量限度
按干燥品计算,含CHNO应为97.0%,103.0%。
4268216
三、性状
本品为应白色结晶性粉末;无臭,味甜
取本品三批检查,结果见表1。
表1甘草酸二铵外观检查结果
批号
白色结晶性粉白色结晶性粉白色结晶性粉
性状
末;无臭,味甜末;无臭,味甜末;无臭,味甜
本品三批均符合规定。
溶解度:
本品在水中易溶,在乙醇中极微溶解,在氯仿或乙醚中几乎不溶。
依法检查(中国药典2000年版二部凡例),检查结果见表2。
表2甘草酸二铵溶解度检查结果
溶剂样品量(g)溶解情况结论
水在1ml中未全溶,在10ml中溶解溶解0.98176
乙醇在10ml中未全溶,在100ml中溶解极微溶解0.01019
氯仿在100ml中未全溶几乎不溶0.00917
乙醚在100ml中未全溶几乎不溶0.01023
本品三批均符合规定。
四、鉴别
1.取本品约0.5g,加稀盐酸4ml与水6ml,煮沸10分钟,放冷,滤过,滤液备用。
取沉淀用水洗涤至中性,105?
干燥1小时,加乙醇10ml
1
使溶解,取乙醇溶液1ml,加10%2,6-二叔丁基对苯甲酚乙醇溶液0.5ml和20%氢氧化钠溶液1ml,至水浴上加热30分钟,液面应出现紫红色悬浮物。
本品三批均呈正反应。
2.取鉴别
(1)项下的滤液1ml,加间苯二酚10ml和盐酸5滴,煮沸1分钟,放冷,加苯3ml,振摇,苯层即显紫红色。
本品三批均呈正反应。
3.取含量测定项下的溶液,照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?
A)测定,在252nm的波长处于最大吸收。
本品三批均符合规定。
4.取本品约50mg,加水5ml使溶解,显铵盐的鉴别反应(中国药典2000年版二部附录?
)。
本品三批均呈正反应。
五、检查
1.有关物质
1.1方法
照高效液相色谱法(中国药典2000年二部附录?
D)测定
色谱条件及系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.02mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至6.5)-乙腈(75:
25)为流动相;检测波长为252nm。
理论板数按甘草酸二铵峰计算应不低于1500。
甘草酸二铵峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
测定法取本品适量,精密称定,用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取适量,加流动相制成每1ml中约含2μg的溶液,作为对照溶液。
取对照溶液10μl注入液相色谱仪进行预试,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%,25%;再取供试品溶液10μl注入液相色谱仪,记录色谱图至主峰保留时间的2倍,供试品溶液的色谱图中如显杂质峰,量取各杂质峰面积的总和不得大于对照溶液主峰面积的10倍(10%)。
1.2.1检测波长的确定
2
取本品适量,精密称定,加流动相溶解并稀释制成每1ml中含有甘草酸二铵40μg/ml的溶液,照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?
A),测定结果见附图9,同法测定中间体?
(7β-氨基-3-[3-甲酰氨基-2-(2-甲酰氧基乙基)-1-吡唑鎓基]甲基-3-头孢烯-4-羧酸双三氟乙酸盐)、中间体?
(7β-氨基-3-[3-氨基-2-(2-羟乙基)-1-吡唑鎓基]甲基-3-头孢烯-4-羧酸盐酸盐)、中间体?
′(1-[(Z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-2-甲氧基亚氨基乙酰基]苯并三氮唑-3-氧化物)紫外最大吸收波长分别为258nm、255nm、257nm,见附图10,12,可见以上中间体在252nm的波长处均有较大吸收,故选择检测波长为252nm。
1.2.2系统专属性试验
取流动相20μl,依法测定,HPLC图谱见图13。
1.2.2系统适用性试验
取甘草酸二铵适量,依法测定,HPLC图谱见图14,按甘草酸二铵峰计算,理论板数为6317,甘草酸二铵峰与相邻杂质峰的分离度为2.21。
1.2.3耐用性试验
照有关物质检查方法,改变流动相组成及流速,进行耐用性试验,结果见表7(其中水相是:
0.02mol/L磷酸溶液,用三乙胺调节pH值为6.5),HPLC图谱见图15,19。
表7甘草酸二铵有关物质检查耐用性试验结果
流动相组成流速(ml/min)理论板数分离度
水相乙腈
75251.084902.31
75250.981502.26
75251.187782.40
76241.082712.22
74261.085062.06
结果表明:
本方法流动相组成及流速发生一定改变时,理论板数及
3
主成分峰与最近杂质峰的分离度均符合规定,说明本方法耐用性良好。
1.2.4.破坏性试验
1.2.4.1酸性破坏试验
取本品约20mg,加0.1mol/L盐酸20ml,回流0.5小时,冷至室温,调节pH值为中性,依法测定,HPLC图谱见图20。
由图可见,本品经酸性破坏后,甘草酸二铵峰与各主要分解产物峰均可分开,最小分离度为4.52。
1.2.4.2碱性破坏试验
取本品约20mg,加0.1mol/L氢氧化钠20ml,回流15分钟,冷至室温,调节pH值为中性,依法测定,HPLC图谱见图21。
由图可见,甘草酸二铵峰与各主要分解产物峰均可分开,最小分离度为8.89。
1.2.4.3氧化破坏试验
取本品约20mg,加30%过氧化氢溶液20ml,回流15分钟,冷至室温,依法测定,HPLC图谱见图22。
由图可见,本品经氧化破坏后,甘草酸二铵峰与各主要分解产物峰均可分开,最小分离度为2.61。
1.2.4.4高温破坏试验
取本品适量,置170?
烘箱中烘烤2小时后,冷至室温,加流动相使溶解,依法测定,HPLC图谱见图23。
由图可见,本品经热破坏后,甘草酸二铵峰与各主要分解产物峰均可分开,最小分离度为8.90。
1.2.4.5光破坏试验
取本品约20mg,置强光照下照射2天,加流动相使溶解,依法测定,HPLC图谱见图17。
由图可见,甘草酸二铵峰与各杂质峰均可分开,与相邻杂质峰的最小分离度为2.0。
1.2.5中间体及粗品的检测
取本品合成过程中的中间体?
、中间体?
、中间体?
′及甘草酸二
4
铵粗品,依法测定,HPLC图谱见图24,27。
由图可见,中间体?
、中间体?
、中间体?
′峰的保留时间与甘草酸二铵峰的保留时间不同,与甘草酸二铵峰可以分开。
甘草酸二铵粗品中主峰与各个杂质峰均可实现基线分离,最小分离度为7.71。
1.2.5检测限的测定
精密称取甘草酸二铵对照品及中间体?
、中间体?
、中间体?
′各适量,加流动相溶解并制成适宜浓度的溶液,作为供试品溶液,依法测定。
同时测定检测器的基线噪音,取信噪比为3:
1时的进样量作为检测限,HPLC图谱见图28,31。
由图可得,甘草酸二铵、中间体?
、中间体?
、中间体?
′的检测限分别为0.2ng、0.5ng、0.3ng、0.8ng。
1.2.6检查结果
取本品三批进行检查,结果见表8,HPLC图谱见图32,37。
表8甘草酸二铵有关物质检查结果
批号031225031226031227
总杂质(%)
2.酸度
取本品0.1g,加水10ml使溶解,依法测定(中国药典2000年版二部附录?
H),pH应为4.0,5.0。
表11甘草酸二铵酸度检查结果
批号
4.34.44.3酸度
结果表明,本品三批均符合规定。
3.溶液的澄清度与颜色
取本品1.0g,加水10ml,加热使溶解后,溶液应澄清无色;如显色,与黄色3号标准比色液(中国药典2000年版二部附录?
A)比较,不得
5
更深。
表9甘草酸二铵溶液的澄清度与颜色检查结果
批号
溶液的澄清度符合规定符合规定符合规定
溶液的颜色符合规定符合规定符合规定结果表明,本品三批均符合规定。
4.干燥失重
取本品,在80?
减压干燥至恒重,减湿重量不得过5.0%(中国药典
2000年版二部附录?
I)
表10甘草酸二铵干燥失重检查结果
批号
3.62.93.1干燥失重(%)
结果表明,本品三批均小于5.0%。
5.炽灼残渣
取本品1.0g,依法检查(中国药典2000年版二部附录?
N),遗留
残渣不得过0.2%。
取本品三批进行检查,结果见表12。
表12甘草酸二铵炽灼残渣检查结果
批号
炽灼残渣(%)0.060.080.07结果表明,本品三批均符合规定。
6.重金属
取炽灼残渣项下遗留的残渣,依法检查(中国药典2000年版二部附
录?
H第二法),含重金属不得过百万分之十。
取本品三批进行检查,结果见表13。
6
表13甘草酸二铵重金属检查结果
批号
重金属(ppm)<10<10<10
结果表明,本品三批均符合规定。
7.硫酸盐
取本品0.5g,加稀盐酸5ml与水10ml,加热10分钟,放冷滤过,残渣用少量水洗涤二次,合并洗涤液和滤液,用氨试液中和,滤液如显色,加过氧化氢试液1ml,水浴加热10分钟,滤过,滤液用少量水洗涤二次,合并洗液和滤液,至50ml纳氏比色管中,依法检查(中国药典2000年版二部附录?
B),如发生浑浊,与标准硫酸钾溶液1.0ml制成的对比液比较,不得更浓(0.02%)。
表13甘草酸二铵重金属检查结果
批号
硫酸盐<0.02%<0.02%<0.02%
结果表明,本品三批均符合规定。
8.砷盐
取无水碳酸钠1g,铺于坩埚底部与四周,再取本品1.0g,置无水碳酸钠上,用少量水湿润,干燥后,先用小火灼烧使炭化,再在500,600?
炽灼使完全灰化,放冷,小心滴加稀盐酸5ml,使残渣溶解,蒸干,加水5ml溶解,加盐酸5ml与水18ml,依法检查(中国药典2000年版二附录?
J第一法),应符合规定(0.0002%)。
7
表13甘草酸二铵砷盐检查结果
批号
砷盐符合规定符合规定符合规定
9.细菌内毒素
9.1方法:
中国药典2000年版二部附录?
E。
9.2供试品细菌内毒素限值(L)的确定
临床剂量为每次30ml,用10%葡萄糖注射液250ml稀释后。
静脉滴注M=30/(1.5×50)=0.40ml/kg/hr,则L=K/M=5/0.40=12.5EU/ml。
9.3干扰试验
9.3.1试验材料
9.3.1.1鲎试剂
LotNo0310210λ=0.125EU/ml规格:
0.1ml/支湛江安度斯生物有限公司生产
LotNo031018λ=0.125EU/ml规格:
0.1ml/支湛江海洋生物制品厂
9.3.1.2细菌内毒素工作标准品
LotNo0310010效价:
10EU/支湛江安度斯生物有限公司生产
9..3.1.3细菌内毒素检查用水
LotNo20031031规格:
5ml/支湛江安度斯生物有限公司生产
9.3.1.4其他玻璃实验用具均在250?
灭菌2小时后使用。
9.3.2实验条件:
水浴温度(37?
1)?
保温时间(60?
2)min。
9.3.3鲎试剂灵敏度复核试验
按照中国药典2000年版二部附录?
E细菌内毒素检查法,对所用鲎
8
试剂的灵敏度进行复核,结果见表14。
表14鲎试剂灵敏度复核试验结果
内毒素浓度(EU/ml)
TAL批号标示灵敏度(λ)λc
0.250.1250.06250.03125NC
0310180.125EU/ml++++++++++++------0.125EU/ml03102100.125EU/ml++++++++++++------0.125EU/ml
从试验结果可以看出,我们所选用的鲎试剂灵敏度均符合规定。
9.4干扰预试验
甘草酸二铵最小有效稀释浓度(缩写MVC)按公式MVC=λ/L,λ为鲎试剂标示灵敏度,L为甘草酸二铵的细菌内毒素限值,目前市售鲎试剂灵敏度λ最低在0.03EU/ml,则甘草酸二铵的最低有效稀释浓度为0.012mg/ml,将甘草酸二铵用内毒素检查用水分别稀释最终浓度为:
10、2、0.5、0.1、0.012mg/ml,将此系列溶液记为NPC,同时在上述试验液中加入标准细菌内毒素溶液,使每一浓度试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素,记此系列溶液为PPC,取标示灵敏度为0.125EU/ml的不同厂家的鲎试剂,分别与上述NPC和PPC进行反应,每一浓度重复2管,并设阳性和阴性对照。
其中NPC出现阳性或PPC出现阴性则表示有干扰影响,结果见表15、表16。
表15甘草酸二铵干扰预试验(安度斯)
20.50.1干扰浓度100.012NC
NPC------------反应结果
PPC----++++++++
表16甘草酸二铵干扰预试验(海洋生物)
20.50.1干扰浓度100.012NC
NPC------------反应结果
PPC----++++++++
由以上预干扰试验结果可以初步了解:
甘草酸二铵对内毒素与鲎试
9
剂反应存在干扰,当甘草酸二铵浓度在0.5mg/ml以下可排除干扰作用,且不同厂家的鲎试剂反应结果完全一致。
9.5正式干扰试验
为了最终确认是否存在抑制因素的影响,特进行如下正式干扰试验。
取甘草酸二铵用细菌内毒素检查用水进行稀释,使其最终干扰试验浓度为0.5mg/ml,按中国药典2000年版二部附录中的细菌内毒素供试品干扰试验进行,结果见表17、表18。
表17甘草酸二铵干扰试验(安度斯)
内毒素浓度(EU/ml)
样品批号
0.250.1250.06250.03125NCEtEs030109++++++++----------0.125EU/ml030115++++++++----------0.125EU/ml030121++++++++----------0.125EU/ml水溶液++++++++----------0.125EU/ml
表18甘草酸二铵干扰试验(海洋生物)
内毒素浓度(EU/ml)
样品批号
0.250.1250.06250.03125NCEtEs030109++++++++----------0.125EU/ml030115++++++++----------0.125EU/ml030121++++++++----------0.125EU/ml水溶液++++++++----------0.125EU/ml
正式干扰试验结果可以再次确认:
甘草酸二铵用鲎试剂检测在稀释浓度0.5mg/ml时无干扰因素的影响。
取样品三批进行测定,结果均符合规定。
四、含量测定
(一)分光光度法
1.方法
照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?
A)测定。
10
测定法取本品,精密称定加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含40μg的溶液,照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?
A)测定,在252nm的波长处测定吸收度。
另取经105?
干燥至恒重的烟酰胺对照品,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含20μg的溶液,在261nm的波长处测定吸收度,乘以1.898。
即得甘草酸二铵含量。
2.方法学研究
2.1精密度试验
取烟酰胺对照品适量,精密称定,用水溶解并稀释制成1ml中约含烟酰胺20μg的溶液,依法测定,重复6次,结果见表21。
表21含量测定精密度试验结果
浓度吸光度A?
SDRSD(%)
10.496
20.492
30.504
0.495?
0.012.02
40.489
50.497
60.490
结果表明,本方法的精密度良好。
2.2溶液的稳定性考察
取上述供试品溶液,于不同时间取样,依法测定,结果见表22。
表22溶液稳定性试验结果
RSD(%)时间(小时)吸光度A?
SD
00.488
20.492
0.493?
0.0142.030.498
60.502
80.487
由表可见,供试品溶液的稳定性符合测定要求。
11
2.3线性范围的测定
精密称取烟酰胺对照品适量,用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含烟酰胺0.4mg的溶液,精密量取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0ml,分别置于100ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,照分光光度法(中国药典2000年版二部附录?
A),记录吸光度,绘制工作曲线,结果见表23,工作曲线见图68。
表23含量测定方法线性范围测定结果
序号浓度(μg/ml)吸光度A
10.39516.03
20.44618.04
30.49420.04
40.54622.04
50.59824.05
以浓度C(μg/ml)对峰面积,进行线性回归,得回归方程为:
,0.0252,-0.0102r,0.9999
结果表明:
烟酰胺的浓度在16,24μg/ml范围内,线性关系良好。
说明本方法线性范围符合测定要求。
2.4回收试验
取甘草酸二铵约32mg、40mg、48mg,精密称定,用水溶解并稀释制成每1ml中约含0.32mg、0.40mg、0.48mg的溶液,精密量取各溶液10ml分别置于100ml量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液,依法测定,计算回收率,结果见表19。
12
表19注射用头孢尼西钠含量测定方法的回收试验结果比例加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)?
SDXRSD(%)
32.8832.5599.0031.4231.3699.7899.51?
0.4280,0.4232.3732.1099.16
32.6932.70100.01
33.2532.7798.56
41.3240.8998.96
41.4641.1999.3599.52?
0.430.43100,40.6540.4499.48
40.9540.8199.67
41.3641.41100.13
48.9848.7899.61
48.2248.34100.250.4699.60?
0.46120,48.6748.4199.46
48.5448.0498.97
47.7547.5999.68
结果表明,甘草酸二铵浓度在32,40μg/ml范围内,回收率好,可作
为本品的含量测定方法。
3.测定结果
取本品三批依法测定,见结果见表24。
表24甘草酸二铵含量测定结果
批号030109030115030121
含量(%)
(二)高效液相色谱法
1.方法
照高效液相色谱法(中国药典2000年二部附录?
D)测定色谱条件及系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以
0.02mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至6.5)-乙腈(75:
25)为流
动相;检测波长为252nm。
理论板数按甘草酸二铵峰计算应不低于1500。
甘草酸二铵峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
测定法取本品适量,精密称定,用流动相溶解并稀释制成每1ml
13
中约含0.2mg的溶液,作为供试品溶液;精密量取适量,加流动相制成每1ml中约含2μg的溶液,作为对照溶液。
取对照溶液10μl注入液相色谱仪进行预试,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%,25%;再取供试品溶液10μl注入液相色谱仪,记录色谱图至主峰保留时间的2倍,供试品溶液的色谱图中如显杂质峰,量取各杂质峰面积的总和不得大于对照溶液主峰面积的10倍(10%)。
2.方法学研究
2.1精密度试验
取甘草酸二铵对照品适量,精密称定,用水溶解并稀释制成1ml中约含甘草酸二铵0.2mg的溶液,依法测定,重复6次,结果见表21。
表21含量测定精密度试验结果
浓度峰面积A?
SDRSD(%)
1
2
3
4
5
6
结果表明,本方法的精密度良好。
2.2溶液的稳定性考察
取上述供试品溶液,于不同时间取样,依法测定,结果见表22,HPLC图谱见图58,62。
表22溶液稳定性试验结果
RSD(%)时间(小时)峰面积A?
SD
0
2
4
14
6
8
由表可见,供试品溶液的稳定性符合测定要求。
2.3线性范围的测定
精密称取烟酰胺对照品适量,用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含甘草酸二铵0.4mg的溶液,精密量取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0ml,分别置于10ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,精密量取10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,量取峰面积,绘制工作曲线,结果见表23,HPLC图谱见图63,67,工作曲线见图68。
表23含量测定方法线性范围测定结果
序号浓度(μg/ml)吸光度A
1
2
3
4
5
以浓度C(μg/ml)对峰面积,进行线性回归,得回归方程为:
,41.722,+9.8782r,0.9999
结果表明:
甘草酸二铵的浓度在0.16,0.24mg/ml范围内,线性关系良好。
说明本方法线性范围符合测定要求。
2.4回收试验
取甘草酸二铵约32mg、40mg、48mg,精密称定,用水溶解并稀释制成每1ml中约含0.32mg、0.40mg、0.48mg的溶液,精密量取各溶液5ml分别置于100ml量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液,依法测定,计算回收率,结果见表19。
15
表19注射用头孢尼西钠含量测定方法的回收试验结果
比例加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)?
SDXRSD(%)
80,
100,
120,
结果表明,甘草酸二铵浓度在0.16,0.24mg/ml范围内,回收率好,可作为本品的含量测定方法。
3.测定结果
取本品三批依法测定,见结果见表24。
表24甘草酸二铵含量测定结果
批号030109030115030121
含量(%)
从试验结果可知,HPLC法与分光光度法测定本品含量结果基本一致,考虑到HPLC法操作较分光光度法精确,因此我们确定HPLC法作为本品的含量测定方法。
五、参考文献
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- 甘草 酸二铵 原料药 质量 研究 资料 10
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