流式细胞仪的工作原理.docx
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流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪的工作原理
将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样,鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包被下单行排列,依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。
(如下图:
FSC&SSC)
前向角散射,即FSC与细胞直径平分正相关,所以我们平时上机的时
候,有时用FSC做阈值,排除碎片及其它颗粒,避免干扰。
侧向角散射,即SSC是指与激光束正交90度方向的散射信号,它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感,可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息~
因此,仅根据FSC/SSC,我们就可以分开全血样本中的淋巴细胞,单核细胞和中性粒细胞~(如下图)
这两种信号同时被前向光电二极管和90?
方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接受方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模,数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理,将分析结果显示在计算机屏
幕上,液可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
(下图为光学系统)
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达,其X轴为测量强度,Y轴为细胞数目。
一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数,这视其模数转换器的分辨率而定。
对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图(histogram),也可以选择二维的散点图(dot
plot)、等高线图(contour)或三维立体视图(pseudo3D)。
(上面有一个直方图了,下图为散点图及三维立体图)
细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。
在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测定细胞就分散在这些液滴之中。
将这些液滴充以正负不同的电荷,当液滴流经带有几千伏特的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,不予充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。
也就是高中学过的带电粒子在电场中运动的原理~
补充细节1:
关于荧光素
荧光信号主要包括两部分:
?
自发荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光;?
特征荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照射激光不同。
自发荧光信号为噪声信号,在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。
在免疫细胞化学等测量中,对于结合水平不高的荧光抗体来说,如何提高信噪比是个关键。
一般说来,细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高,自发荧光越强;培养细胞中死细胞/活细胞比例越高,自发荧光越强;细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是:
?
尽量选用较亮的荧光染料;?
选用适宜的激光和滤片光学系统;?
采用电子补偿电路,将自发荧光的本底贡献予以补偿。
当应用流式细胞术对细胞表面或内部抗原进行检测时,除必要的抗体外,应用各种荧光素也是必不可少的,它包括单标记抗体荧光索、双标记抗体荧光素、三标记抗体荧光素等。
荧光素发射荧光基本原理是:
荧光素受到一定波长(激发波长)的激光激发后,其原子核外的电子由于吸收了激光的能量,由原本运动处于基态轨道跃迁到激发态轨道上运动,然后当电子由激发态重新回到基础态时,释放出能量并发
射出一定波长(发射波长)的荧光。
不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发,所以要选择正确的激光器。
例如,FITC和FE等的微发光波长均为488nm,所以可用产生可见光的氩离子激光器,而APC和PC5等的激发波长在红光范围,需使用发射630nm波长红光的氦—氖激光器。
此外,各种荧光素的发射波长也十分重要,可以据此确定其检测所需光电倍增管性质。
如FITC,被激光激发后发射绿光,检测时要使用第一光电倍增管(即PMTl);PE则发射橙包光,需用第二光电倍增管(即PMT2);PC5和PcrCP等发射的是深红色光,这时需选择第二甚至第四光电倍增管(即PMT3或PMT4)等。
一定要注意激发波长和发射波长的区别~
常用荧光素
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm)。
488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)、CY5(化青素)、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。
他们的激发光和发射光波长分别是:
激发光波长(ηm)发射光峰值(ηm)
FITC488525(绿)
PE488575(橙红)
PI488630(橙红)
ECD488610(红)
CY5488675(深红)
PreCP488675(深红)
(摘自《实用流式细胞术彩色图谱》)
常用荧光素分布图
FITC和PI
PI和EB都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并有与碱基对结合的特异性。
为了获得特异的DNA分布,染色前必须用RNA酶处理细胞,排除双链RNA的干扰。
PI和EB不能进入完整的细胞膜,因此又可以用于检测死细肥。
PI和EB各种理化性质相似,但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动,因而在作DNA和蛋白质双参数测量
时,PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。
另外,Pl
比EB测得的DNA分布的变异系数(CV值)低,所以PI得到更广泛的
应用。
FITC为一种小分子荧光素,其效率(即荧光强度)取决于溶液的
pH值,因此在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。
一些流式常用名字的概念和意义:
Amplifier放大器Electroniccomponentofaflowcytometerthatincreasesthesignalbyanadjustablefactor.
Aneuploid异倍体Havinganabnormalnumberofchromosomes.
AneuploidcellsmayalsohaveanabnormalDNAcontent.
AverageThemeanvalue,whichisthetotalamountdividedbythenumberofcontributors.
Channel常说的荧光道数Themeasuredvalueofaparameter,
representingthesignalintensityofaneventafteramplification.Toappearonaplot,dataforaneventmustfallintooneofeither256channels(0-255)oroneof1024channels(0-1023)dependingontheresolutionoftheplot.
Compensation(荧光)补偿Anelectroniccalculationthatremoves
signaloverlapwhichtheopticalsystemcannotremove.Fluorescencecompensationworksforspecificpairsoffluorescentparameters;forexample,FL1andFL2.
CursorForFACScans:
ahighlightappearinginadatafieldthatindicatesyoucanmodifythisfield.Onadotplot,acrosshairfordrawingapolygongate.Onotherflowcytometers:
alineseparatingregionsonsingleparameterhistogramsthataretreatedstatisticallyseparate.Seemarker.
%CVCV值~表示其集中分散趋势。
Percentcoefficientofvariationis
ameasureofpeakdistribution.Thepercentcoefficientofvariationisthestandarddeviationofthepeakdividedbythemeanchannelnumberofthepeak,times100.
Diploid二倍体Havingthenormalnumberofchromosomepairsfornon-reproductive,mammaliancells.TheamountofDNAindiploidcellsdefinesthenormalDNAcontentforthespecies.
DNAIndexTheratioofGO/G1peakchannelinaDNAhistogramoftheexperimentalsampletotheGO/G1peakchannelofthereferencesample,whennormalhumandiploidcellsornucleiarethereference.
ThisisameasureofDNAaneuploidy,orabnormalDNAcontent.
DotPlotAtwoparameterdatagraphusedforacquisitionandanalysis.Eachdotonthedisplayrepresentsoneeventthattheflowcytometeranalyzed.
Doublet分选中常用的概念。
Twoparticlesstucktogether,whicha
flowcytometerrecordsasonelargerevent.Particlesmayalsooccurintripletsandhigherassociations.
EventAunitofdatarepresentingoneparticleorcell.Aneventhasarelativeintensityvalueandchannelnumberforeachparameter.
FilterAnopticaldeviceusedtoattenuateparticularwavelengthsorfrequencieswhilepassingothers.
FL1,GreenFluorescencesignalreceivedbythephotomultipliertube(PMT),FL1.TherangeofthesignaldetectedisdependentonthefiltersassociatedwiththePMT.ForFACScansandFACSCaliburs,FL1measureslightinthegreenrangeofthespectrum(515to545nm).
FL2,Orange-RedFluorescencesignalreceivedbythe
photomultipliertube,FL2.ForFACScansandFACSCaliburs,FL2measuresorange-redlight(564-606nm).
FL3,RedFluorescencesignalreceivedbythephotomultipliertube,FL3.ForFACScans,FL3measuresredlight(above650nm).ForFACSCaliburs,FL3measuresredlight(above670nm).
FL4,Red-OrangeFluorescencesignalreceivedbythe
photomultipliertube,FL4.ForFACSCaliburs,FL4measuresred-orangelight(653-669nm).
FluorescenceApropertyofmoleculestoabsorblightatonewavelengthandemitlightatalongerwavelength.FlowcytometersdetectFluorescenceemissionata90degreeangletotheexcitinglightbeam.
ForwardScatter(FSC)前向角Aparametermeasuringlight
scatteredlessthan10degreesasacellpassesthroughthelaserbeam.TheFSCmeasurementisrelatedtocellsize.
G0Phaseofcellcycledesignatingcellsthatarequiescentandhave
notyetenteredthegrowthcycle.Normalcellsinthisphasehaveexactlyonesetofchromosomepairs.
G1Phaseofcellscycleinwhichcellsarecommittedtodivision.ThesecellshavethesamenumberofchromosomesandthesameamountofDNAasGOphasecells.TheyareabouttoenterSphasewheretheysynthesizeDNA.
G2PhaseofcellscycleinwhichproliferatingcellshaveduplicatedtheirDNAandformedtwosetsofchromosomepairs,inpreparationfordivision.G2followstheSphaseandprecedestheM(mitosis)phase.
Gain增益Anadjustmentthatmodifiesamplifierresponses.
Increasingthegainincreasestheelectronicpulse(andtherelativefluorescenceintensityvalueandthechannelvalue)inresponsetoalightsignal.
Gate翻译过来后还是觉得称之为“gate”好~Aboundarythatdefines
asubsetorsub-populationofevents.Gatesaresetbydrawingboundariesaroundthesubsetsondataplots(dotplotsorhistograms).Usegateseitherfordataacquisitionoranalysis.Inclusivegatesselect
onlytheeventsthatfallwithin(andon)theboundary.Exclusivegatesselectonlytheeventsthatfalloutsideoftheboundary.
Livegate与上面的“gate”不同,是作为记录的条件的gate,不在
gate之内的数据不被存入电脑~Gatethroughwhichanydatafrom
theflowcytometer/computerparallelinterfacemustpassbeforeacquisition.Anydataoutsidethegatedoesnotenterthecomputer.
Haploid单倍体Havingonesetofsinglechromosomes.
Reproductivecells,likeeggsandsperm,arehaploid.
HistogramAdataplotofasingleparameter.Thisdisplayseithertherelativefluorescenceintensityvalueorthechannelnumberonthexaxisandthenumberofeventsontheyaxis.
Linearscale线性Thescaleonwhichtheoutputisdirectly
proportionaltotheinput.WhenthecontrolissetatLinear,thevoltagemeasuredisdirectlyproportionaltothechannelintowhichtheeventfalls.
Logarithmicscale对数Thescaleonwhichthevaluesincrease
logarithmically.ThisscaleisusedwhentheinstrumentissettoLOG.
Therearefourdecadesacrossthe1024channelsonFACScan(256channelsperdecade).Thescalerangesfrom1to10,000.ForFACScan,thenumberofdecadesisfixed.
MPhaseofthecellcycle,mitosis,duringwhichacelldividesintotwo.ThisprecedesGO/G1andfollowsG2.MphaseandG2cellscontainthesameamountofDNAandthesamenumberofchromosomes.Innormalcells,thisisthetetraploidnumber(4N)ofchromosomes.
Marker就是第五篇中的一张图上面的M1,M2等。
作为统计时的
分界区域限制。
Alineseparatingregionsonsingleparameterhistogramsthataretreatedstatisticallyseparate.Seecursor.
ParameterAmeasurementoflightintensity,eitherscatteredoremittedfluorescence,fromaparticleasitpassesthroughalaserbeam.Forallfiveparameters(FSC,SSC,FL1,FL2,FL3)theheightoftheelectronicpulsethatisgeneratedisused.Inaddition,forcellcycleanalysisCellQuestsoftwarecanmeasureeitherFL2areaandFL2width(forstainingwithpropidiumiodide)orFL3areaandFL3width(forstainingwith7-amino-actinomycinD).
Photodiode光电二极管,将光信号转化为电信号。
Asemiconductor
deviceusedtodetectlightandgenerateanelectricalcurrent.Typicallyusedinforwardscatter(FSC)detection.
Photomultiplier光电倍增管Aphotodetector,withadjustable
voltage,thattranslatesopticaltube(PMT)signalsintoelectricalcurrent.PMTdetectorsareusedforSSCandfluorescenceparameters.IncreasingthePMTvoltage,increasestheoutputsignalforagivenamountoflight.
Ploidy倍性Thenumberofchromosomespresentinthecell.TheamountofDNAinacellgivesanindicationoftheploidy,butisnotdirectlyproportional.SeeHaploid,Diploid,andAneuploid.
Pulse不是脉搏,是脉冲~Theelectronicsignalgeneratedbya
particle(
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- 细胞 工作 原理