大肠菌群检测重点.docx
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大肠菌群检测重点.docx
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大肠菌群检测重点
曹双:
请综合看看各种方法,比较一下,有些内容是一致的,有些是每种方法不同于其他方法的,注意比较。
第一篇
(蓝色部分为说明和附录,去掉这部分剩下的为连续文件)
大肠杆菌检验方法
SN0169—92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
GB/T4789.6—1994 食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验(这两个检验方法另有完全的PDF文件,见文件夹)
以SN标准方法为例,进行说明。
样品制备:
以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:
10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
附:
这是一种9管MPN法测定方法,什么是MPN法(最近似法)?
MPN法简介
发布日期:
2010-05-13 浏览次数:
212
TheMostProbableNumberMethod Inthefollowingexample,asetof3tubesofanallpurposebrothmediumisinocu
TheMostProbableNumberMethod
Inthefollowingexample,asetof3tubesofanallpurposebrothmediumisinoculatedfromeachoftheten-folddilutions,witheachtubebeinginoculatedwithoneml.
Afterincubation,thenumberoftubesshowinggrowthisrecorded.Asthesucceedingdilutionsweremade,theorganismsweredilutedtosuchanextentthatnonewereintheinoculaofsevenofthetubes(markednegative).Inordertoestimatethenumberoforganismspermlofthesamplewhichwouldcausethiskindofgrowthresponse,welocatethethreesetsoftubeswhichshowdilutionoftheorganisms"toextinction"–i.e.,thosetubeswhichwereinoculatedfromthe10–2,10–3and10–4dilutions.
附 录
1g检样中最近似值(MPN)表(补充件)
以0.1、0.01、0.001g各用3管。
━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━
阳性管数 ┃ ┃ 阳性管数 ┃
━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━┫MPN
0.10.010.001 ┃ |0.10.010.001 ┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
0 0 0 ┃<3 ┃ 2 0 0 ┃9.1
0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃14
0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃20
0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃26
0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃15
0 1 1 ┃ 6.1┃ 2 1 1 ┃20
0 1 2 ┃ 9.2┃ 2 1 2 ┃27
0 1 3 ┃ 12┃ 2 1 3 ┃34
0 2 0 ┃ 6.2┃ 2 2 0 ┃21
0 2 1 ┃ 9.3┃ 2 2 1 ┃28
0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃35
0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃42
0 3 0 ┃ 9.4┃ 2 3 0 ┃29
0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃36
0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃44
0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃53
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
1 0 0 ┃ 3.6┃ 3 0 0 ┃23
1 0 1 ┃ 7.2┃ 3 0 1 ┃39
1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃64
1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃95
1 1 0 ┃ 7.3┃ 3 1 0 ┃43
1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃75
1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃120
1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃160
1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃93
1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃150
1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃210
1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃290
1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃240
1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃460
1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃1100
1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃>1100
━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━
LST和EC初步筛选:
对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。
将接种管置于36±1℃培养48±2h。
观察试管的产气情况:
检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。
附:
LST肉汤、EC肉汤有些什么?
LST肉汤和EC肉汤中有什么?
(发酵乳糖产气)
月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤
EC肉汤
胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase)20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g
月桂基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000.0mL
胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。
分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH6.8±0.2。
将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。
121℃高压灭菌15min,最终H6.9±0.1。
EMB平板:
取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。
检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18~24h。
附:
怎样进行平板划线分离?
平板划线分离的方法
发布日期:
2010-09-01 浏览次数:
202
1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法
1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法
窗体顶端
窗体底端
平板划线示例
平板划线示例
发布日期:
2010-09-01 浏览次数:
612
平板划线示例Thisisanexampleofagoodstre
平板划线示例
Thisisanexampleofagoodstreakforisolationusingthe"fourcorners"method.
ThesmallcolonieshereareofStaphylococcusepidermidis
Thisisnotagreatstreakplatebutitisserviceable,asthereareafewisolatedcolonies.Thisplatewouldhavebeenbetteriftheloophadbeenflamedbetweeneachsector.
ThisisanexampleofhowNOTtostreakforisolation.Scribblingisnotstreaking,andmostlikelywillnotresultinisolatedcolonies
Thisplateisolatestwodifferentcolonies:
Escherichiacoli(thecream-colored)colonies,andSerratiamarcescens(theredcolonies).(粘质沙雷菌)
ThisisaplatewithMicrococcusluteus滕黄微球菌,theyellowcolonies.Whilethisisagoodstreakforisolation,theplatehasbeencontaminated.Thelarge"fuzzy"coloniesarefungalcolonies.
Thelidmayhavebeenliftedtoofarawayfromtheplatewhilestreaking,oradraftmayhavecausedthesporestofallintotheplate.
EMB平板原理及照片
EMB平板照片及原理
发布日期:
2010-05-13 浏览次数:
238
Thisimageillustratesthegrowthofgram-negativebacteriathatcannotfermentlactoseoneosinmethyleneblue(
Thisimageillustratesthegrowthofgram-negativebacteriathatcannotfermentlactoseoneosinmethyleneblue(EMB)agar.EMBagarcontainsbilesaltsanddyeswhichinhibitgrowthofgram-positivebacteria.GrowthonEMBagarisausefuldiagnostictooltodistinguishbetweenlactosefermentersandnonfermenterswhichwillappearcolorless.Thisimagecanbeusedtodescribetheuseofmetabolisminidentificationofbacteria.SalmonellaandShigella,bothnonlactosefermentingpathogens,canbedistinguishedfromthemorecommonintestinalflorawhichfermentlactose.
lnfemb-an.jpgLactoseNonfermenteronEMB
PatJohnson,PalmBeachCommunityCollege,LakeWorth,Fla.,USA
窗体顶端
窗体底端
生化试验:
将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
1 色氨酸肉汤:
在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2~0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
附:
靛基质试验原理及照片
靛基质试验原理及照片
发布日期:
2010-05-13 浏览次数:
290
靛基质(Indole)试验:
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基
靛基质(Indole)试验:
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。
试验方法:
将待试纯培养物小量接种于试验培养基管,于36±1C培养24h时后,取约2ml培养液,加入Kovacs氏试剂2~3滴,轻摇试管,呈红色为阳性,或先加少量乙醚或二甲苯,摇动试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培养液表面后,再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴,在接触面呈红色,即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应,若先用二甲苯或乙醚等进行提取,再加试剂,则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色,因而结果更为可靠。
Margaret(Peg)Johnson,MesaCommunityCollege,Mesa,Ariz.,USA
Thisimagedepictstheresultsofnegativeandpositiveindoletests.TheindoletestisfrequentlyemployedtodistinguishKlebsiellaorEnterobacterbacteria(indolenegative)fromEscherichiacoli(indolepositive).ThepresenceofE.coliisusedbypublichealthofficialsasanindicatoroffecalcontaminationoffoodandwatersupplies.
Priortothistest,Enterobacteraerogeneswasusedtoinoculateonetryptonebroth,whileanothertryptonebrothwasinoculatedwithEscherichiacoli.Thetwobrothswerethenincubatedfor24handmixedwithKovasreagent(p-dimethylamino-benzaldehyde).Tryptonebrothisrichintheaminoacidtryptophan.Tryptophanase,anenzyme,iscapableofcleavingtryptophanandproducingindole,pyruvicacid,andammonia.IndolecanbedetectedbythedevelopmentofaredcolorafteraddingKovasreagent.Organismsthatdonotproducetryptophanasewillbeindolenegative,asnoindolewillbepresenttoreactwiththeKovasreagent
2MR-VP培养基:
在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm试管中,加5%α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40%氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。
如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
附:
MR-VP试验原理及照片
MR-VP试验原理及照片
发布日期:
2010-05-13 浏览次数:
224
甲基红(MethylRed)试验 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径
甲基红(MethylRed)试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红。
V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-P(+)反应。
大肠杆菌:
MR+/VP-
3Koser氏枸椽酸盐肉汤:
于36±1℃培养96h记录有无生长。
附:
枸椽酸盐利用试验原理及斜面显色照片
枸椽酸盐试验原理及斜面照片
发布日期:
2010-05-13 浏览次数:
136
枸椽酸盐试验:
某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源,及磷酸铵作为氮源,将枸椽酸盐分解为二氧化碳,培养基反应后成碱性,由于
枸椽酸盐试验:
某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源,及磷酸铵作为氮源,将枸椽酸盐分解为二氧化碳,培养基反应后成碱性,由于指示剂的作用,培养基变为兰色。
说明:
SN标准所用培养基是肉汤培养基,且不加指示剂,因此,只能观察是否浑浊生长。
Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 1.5g
磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g
枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10mL,121℃高压灭菌15min。
最终pH6.7
±0.2。
4LST肉汤:
于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
5 革兰氏染色:
取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。
大肠杆菌为革兰氏阴性。
大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下:
━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
靛基质┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸盐┃鉴定(型别)
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
+ ┃ + ┃ - ┃ - ┃典型大肠杆菌
- ┃ + ┃ - ┃ - ┃非典型大肠杆菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
+ ┃ + ┃ - ┃ + ┃典型中间型
- ┃ + ┃ - ┃ + ┃非典型中间型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
- ┃ - ┃ + ┃ + ┃典型产气肠杆菌
+ ┃ - ┃ + ┃ + ┃非典型产气肠杆菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做
重复试验。
结果报告:
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为++
--或-+--,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN
值。
第二篇
大肠菌群测定的操作细则(MPN法)
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1设备和材料
1.1温箱:
36±1℃。
1.2冰箱:
0~4℃。
1.3恒温水浴:
44.5±0.5℃。
1.4天平。
1.5显微镜。
1.6均质器或乳钵。
1.7平皿:
直径为90mm。
1.8试管。
1.9吸管。
1.10广口瓶或三角烧瓶:
容量为500mL。
1.11玻璃珠:
直径约5mm。
1.12载玻片。
1.13酒精灯。
1.14试管架。
2培养基和试剂
2.1乳糖胆盐发酵管:
按GB4789.28中4.9规定。
2.2伊红美蓝琼脂平板:
按GB4789.28中4.25规定。
2.3乳糖发酵管:
按GB4789.28中4.10规定。
2.4EC肉汤:
按GB4789.28中4.11规定。
2.5磷酸盐缓冲稀释液:
按GB4789.28中3.22规定。
2.6生理盐水。
2.7革兰氏染色液:
按GB47
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