综合性实验植物DNA的提取及电泳.docx
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综合性实验植物DNA的提取及电泳
本科学生综合性实验报告
学号:
124120434姓名:
云谣
学院:
生命科学学院专业、班级:
12生物技术
实验课程名称:
植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作
教师:
郝大海
开课学期:
2021至2021学年上学期
师大学教务处编印
实验序号
一
实验名称
植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作
实验时间
第十五周
实验室
睿智3--428
一、实验目的
1、了解植物DNA提取方法,熟悉操作步骤
2、掌握植物大分子操作考前须知及试剂用具准备方法
3、掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法
4、了解PCR原理,熟悉操作步骤
5、掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法
二、实验原理
1、DNA提取的原那么:
〔1〕保证DNA一级构造的完整性
〔2〕排除其它分子的污染RNA、蛋白质、多糖等
2、在浓氯化钠溶液(1~2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.
3、别离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:
〔1〕、用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA.
〔2〕、用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸别离,从而从材料中直接提取出DNA.
〔3〕、用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后那么停留在酚层.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀
4、DNA提取方法:
〔1〕CTAB法原理:
CTAB〔十六烷基三甲基溴化铵〕,是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。
在高盐溶液中〔>0.7mol/LNaCl〕,该复合物可溶。
之后用有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质,最后在上清液中参加乙醇沉淀DNA。
注意CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其参加冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
〔2〕SDS法
SDS阴离子去垢剂在高温〔55~65℃〕下裂解细胞,蛋白变性,染色体离析,在高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度〔冰浴〕使蛋白质及多糖杂质沉淀,之后上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,最后乙醇沉淀水相中的DNA。
5、DNA质量检测:
紫外分光光度计检测法,嘌呤和嘧啶的母环含有共轭双键,因此也有紫外吸收现象,且在260nm和280nm处也存在吸收峰。
蛋白质中含苯环的氨基酸在这两个波长下也会发生光吸收。
因此,通过260nm和280nm下样品的吸收值比率可判断核酸纯度。
6、琼脂糖电泳:
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于别离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,到达别离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
7、PCR实验原理
聚合酶链式反响(polymerasechainreaction,PCR),是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法。
在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸假设干个循环后,DNA扩增2n倍。
PCR反响的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反响延伸三个步骤完成的。
图中设定的反响参数是94℃变性1min,60℃退火1min,72℃延伸1.5min。
如此周而复始,重复进展,直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
三、实验设备及材料
〔一〕、仪器设备
1.5ml离心管;5ml离心管;研磨棒;5ml吸头;1000ul吸头〔盒〕;200ul吸头〔盒〕;10ul吸头〔盒〕;5ml移液器;1000ul移液器;200ul移液器;30ul移液器;2ul移液器;试剂瓶;量筒、恒温水浴锅;高速离心机;紫外分光光度计;电泳仪;电泳槽;酸度计;电子天平;PCR仪
〔二〕、试剂
CTAB;NaCl;Tris;HCl;H3BO4;EDTA;NaOH;PVP;琼脂糖;EB;引物;dNTP;Taq酶;EB
〔三〕、材料:
马铃薯叶
四、实验方法步骤
〔一〕、DNA的提取;
1、取100mg新鲜叶片,置于预冷1.5ml离心管中,参加液氮,研为细粉。
参加350μl新鲜2×CTAB缓冲液,再仔细研磨。
〔CTAB用于抽提DNA〕
2、350μl新鲜2×CTAB缓冲液,冲洗研磨棒,参加2μlβ-巯基乙醇,混匀。
65℃水浴45分钟,每15分钟摇动一次。
冷却至室温,静置2分钟。
3、每支离心管参加700μl氯仿:
异戊醇〔24:
1〕〔672氯仿:
28异戊醇〕混合液。
轻柔短暂地混和,防止DNA断裂。
颠倒几次。
〔氯仿、异戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白质〕
4、在微型离心机中,以14,000rpm离心5分钟。
移取上层水层,置于新的、标识好的1.5ml离心管中。
注意防止取到中层物质。
将氯仿:
异戊醇废液倒入废液缸。
5、参加50μl10%CTAB〔溶于0.7MNaCl〕,轻柔混和,并保证混和完全。
6、重复第3、第4步。
7、每支离心管中参加等体积异丙醇〔400-500μl〕。
上下颠倒几次,4℃静置20分钟〔或-20℃,15分钟〕。
〔异丙醇用于沉淀DNA〕
8、14,000rpm离心20分钟。
小心倒出上清夜,防止DNA颗粒丧失。
倒置离心管,空气枯燥〔1-2分钟〕。
9、用1ml70%乙醇清洗DNA〔3分钟〕,14,000rpm离心30分钟。
小心倒出70%乙醇,用1ml90%乙醇清洗DNA,14,000rpm离心30分钟,小心地倒去乙醇。
倒置离心管,空气中枯燥,或用真空泵枯燥15分钟。
〔乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸〕
10、以150μlT10E1或蒸馏水溶解DNA,参加1~2μl不含DNA酶的RNA酶A〔10mg/ml〕。
37℃反响1小时。
11、4℃保存〔-20℃长期保存〕。
〔二〕、琼脂糖凝胶电泳
1、取5×TBE缓冲液20mL加水至100mL,配制成1×TBE稀释缓冲液,待用。
2、胶液的制备:
称取0.4g琼脂糖,置于200mL锥形瓶中,参加50mL1×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为1%琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
3、胶板的制备:
将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏严密封住。
将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中参加溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/mL。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽,使胶液形成均匀的胶层。
待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽参加1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上外表。
4、加样:
取10μLDNA样品与2μL6×上样液混匀,用微量移液枪小心参加样品槽中。
假设DNA含量偏低,那么可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,防止损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳:
加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。
控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停顿电泳。
6、染色:
未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中,室温下染色20-25min。
7、观察和拍照:
在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。
五、实验考前须知
1、EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。
但凡沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。
沾染了EB的垃圾要专门处理后才可丢弃。
2、当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30min后再观察。
3、制备凝胶时,倒胶的温度不可太低,否那么凝固不均匀:
速度也不可太快,否那么容易出现气泡。
4、CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参加乙醇沉淀即可使核酸别离出来。
5、注:
CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此,在将其参加冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
6、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖;
7、蛋白质的去除:
酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸别离,纯化;
8、多糖的去除:
高盐法:
用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中参加1/2体积的5MNaCl,高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖。
用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:
在500μLDNA液中参加200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl),冰浴20min.核酸别离,纯化;
9、多酚的去除:
在抽提液中参加防止酚类氧化的试剂:
β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫糖醇等参加易与酚类结合的试剂:
如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合;
10、盐离子的去除:
70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用适宜的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,到达纯化DNA的目的另一种方式参加1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等假设长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNasepH值为8.0,可防止DNA发生酸解。
七、实验结果及分析
〔一〕、实验结果
纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8,OD260m/OD230应大于2.0。
1、OD260/OD280大于1.9时,说明有RNA污染。
2、小于1.6时,说明样品中存在蛋白质或酚污染;
3、OD260/OD230小于2.0时,说明溶液中有残存的盐和小分子杂质,如核苷酸、氨基酸、酚等。
注:
可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。
只有当DNA的OD260/OD280接近于1.8时才值得去电泳。
本次实验的结果为:
OD260:
2.6
OD280:
1.2
OD260/OD280=2.6/1.2=2.1
电泳结果如下:
条带最多的是DNAmark样本,它的围在200-4000之间,其他的为实验中提取的DNA经过PCR反响后得到的DNA样品,经过电泳之后就可以通过比拟条带的远近和mark条带上的位置,就可以知道经过PCR后得到的DNA了。
〔二〕、结果分析
本次实验历时一天,流程复杂,要求高。
由于在本次实验中,我们组在有的步骤处理过程中出现一点点意外,故没有提取到较高程度的DNA,在PCR的过程中也就没有得到较好的DNA产物,故没有参与电泳。
八、参考文献
肖尊安植物生物技术.高等教育,2021.
许智宏.植物生物技术.科学,2002.
指导教师评语
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日期:
年月日
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- 综合性 实验 植物 DNA 提取 电泳