高级生物化学与分子生物学综合实验报告.docx
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高级生物化学与分子生物学综合实验报告
高级生物化学与分子生物学
综合实验报告
1、实验目的
以特定酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化为主线,进行基因操作、蛋白质表达、亲和层析纯化等的训练,通过集中训练熟练生物化学和分子生物学实验操作,为独立开展研究生课题研究奠定实验基础。
2、实验原理
利用基因重组技术,将目的基因与载体质粒DNA在体外进行重组,然后把这种重组DNA转化到感受态细胞,通过一定的诱导条件,使之在受体细胞内增值表达相应的目标蛋白。
为了得到相应的目标蛋白,需要通过亲和层析等手段纯化目标蛋白。
三、实验内容
一)内容一:
重组质粒的分离、鉴定与转化
实验1.重组质粒的分离、纯化及检测
实验2.质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收
实验3.感受态细胞的制备、连接与转化
二)内容二:
重组蛋白在大肠杆菌中的表达
实验4.细菌的大量培养及重组蛋白的诱导
三)内容三:
重组蛋白的提取、纯化与鉴定
实验5.细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化
实验6. 目标蛋白的SDS-PAGE鉴定
实验1质粒DNA的分离、纯化及检测
材料、设备及试剂
一、材料
转化的细菌,1.5ml塑料离心管,离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽灭菌锅,涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
三、试剂
1.LB液体培养基(Luria-Bertani):
称取蛋白胨(Tryptone)5g,酵母提取物(Yeastextract)2.5g,NaCl5g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积500mL,高压下蒸气灭菌20分钟。
2.LB固体培养基:
液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。
3.氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液:
配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备。
4.质粒提取试剂盒。
操作步骤
1.细菌的培养和收集
将含有质粒的菌种用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到2-5mlLB液体培养基(含50μg/mlAmp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
2.取液体培养物1.2mL于Eppendorf管中,然后6000g/min离心2min,弃上清。
3.质粒的提取,参照质粒提取试剂盒说明。
4.-20℃保存DNA以备电泳检测。
实验2质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收
材料、设备及试剂
一、材料
质粒;HindⅢ酶及其酶切缓冲液;琼脂糖(Agarose)
二、设备
水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪。
三、试剂
50×TAE电泳缓冲液;6×电泳载样缓冲液。
操作步骤
一、DNA酶切反应
1.反应体系组成:
10XBuffer5μL
HindIII1μL
Plasmid20μL
H2O24μL
2.混匀反应体系后,将eppendorf管置于泡沫板上,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
3.停止反应,置于冰箱中保存备用。
二、琼脂糖凝胶电泳
1.取50×TAE缓冲液4ml加水至200ml,配制成1×TAE稀释缓冲液,待用。
2.胶液的制备:
称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml1×TAE稀释缓冲液,轻轻摇匀,溶胀30min,放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化。
3.胶板的制备:
将有机玻璃胶槽放好,插上样品梳子。
将冷却至50-60℃的琼脂糖胶液小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。
4.加样:
取10μl酶解液与2μl6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。
5.电泳:
加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。
控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。
当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
6.染色观察和拍照。
7.回收条带,用回收试剂盒。
步骤参见试剂盒说明书。
实验3感受态细胞的制备、连接与转化
材料、设备及试剂
一、材料
E.coliBL21/DE3菌株:
Amp-;无菌eppendorf管。
2、试剂
LB液体培养基、T4DNA连接酶、氨苄青霉素、含Amp的LB固体培养基
操作步骤
一、连接反应
1.取新的经灭菌处理的1.5mleppendorf管,编号。
2.体系组成:
共10μl
Buffer1X
回收的DNA片段100ng
T4DNAligase1μL
去离子水
3.顺序:
去离子水、回收的DNA片段、回收的DNA片段、T4DNAligase。
4.混匀后用小离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24h。
2、E.coli感受态细胞转化
3、 1.从4℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,立即置冰上。
4、 2.加入连接产物溶液(体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
3.42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4.向管中加入0.8mlLB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃低转速振荡培养45min,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5.将上述菌液摇匀后取200μl涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置5-10min,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1:
(-)感受态细胞,此组正常情况下应不产生菌落。
对照组2:
(+)1μl质粒,此组正常情况下应产生大量。
实验四细菌的大量培养及外源蛋白的诱导
操作步骤
种子培养液的准备和外源蛋白的诱导表达
1.取冻存的菌种,接种入装有5-10mlLB培养基的瓶中,37℃,200rpm/min过夜培养后接入100mlLB培养基,接种浓度为2%。
2.37℃,200rpm/min培养3小时后,将摇床温度调节到诱导温度20℃并平衡30min,然后加入IPTG至终浓度0.4mM,继续培养过夜。
实验五细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化
材料及试剂
一、材料
经诱导表达目的蛋白的大肠杆菌、Ni-NTA介质(Ni亲和介质)
二、试剂
1.缓冲液:
20mmol/LTris-HCl,pH8.0;
2.缓冲液配制10mM、50mM、100mM、250mM咪唑。
操作步骤一(细菌破碎)
1. 将菌液转入大离心瓶中,离心收菌,4000rpm,10min;
2. 倒掉上清,将菌体悬于10mL缓冲液中,超声破碎细菌;
3. 将破菌产物离心,12000rpm,15min;
4.分别对上清和沉淀留样,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达情况和蛋白
操作步骤二(目标蛋白纯化)
1. 处理介质:
向柱中加入0.5mLNiTA介质后,用5倍柱体积的去离子水洗涤介质;再用5倍柱体积的缓冲液洗涤介质;以下步骤根据蛋白性质在16℃下进行操作;
2. 加入蛋白样品:
加入超声破菌后的蛋白上清样品;
3. 洗涤杂蛋白:
用5倍柱体积的10mM咪唑洗涤介质;
4. 洗涤目标蛋白:
用50mM、100mM、250mM不同浓度的咪唑各2.5ml,梯度洗脱介质,回收流出液,保存于4℃,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
实验六 目标蛋白的SDS-PAGE鉴定
试剂
10%十二烷基硫酸钠(SDS)贮存液、30%丙烯酰胺单体液、浓缩胶缓冲液1MpH6.8的Tris缓冲液和分离胶缓冲液1.5MpH8.8的Tris缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、Tris-甘氨酸电泳缓冲液、样品处理液、染色液、脱色液
操作步骤
一、蛋白电泳用胶的配制
1.安装玻璃板。
2.按表1中给出的数值在一小烧杯中配制分离胶溶液。
表2-1SDS不连续电泳凝胶配方
贮液
分离胶/12%
浓缩胶/3%
30%丙烯酰胺单体贮液/mL
4.0
0.85
分离胶缓冲液1.5MTris/mL(pH8.8)
2.5
--
浓缩胶缓冲液1MTris/mL(pH6.8)
--
0.6
双蒸水/mL
3.4
3.5
10%的SDS溶液/μL
100
50
10%的过硫酸铵溶液/μL
15
8
TEMED/μL
10
8
3.迅速在玻璃板的间隙中灌注丙稀酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需的空间。
再在胶面上小心注入一层水(约2~3mm)高,以阻止氧气进入凝胶溶液。
4.分离胶聚合完全后(约30分钟),倾出覆盖水层,再用滤纸吸净残留水。
5.按表1中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。
注意一旦加入TEMED,马上开始聚合,故应快速操作。
6.在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。
7.在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按1:
1体积比加入样品处理液,在100℃加热5min以使蛋白质变性。
8.浓缩胶聚合完全后(30-60min),小心移出梳子。
将凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
二、上样电泳
1.按预定顺序加样,加样量通常为10~25μL。
电泳检测样品至少包括:
蛋白Marker、上样液(原液)、上样后的穿透液、10mM咪唑冲洗液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。
2.将电泳装置与电源相接,凝胶上所加电压为8V/cm。
当染料前沿进入分离胶后,把电压提高到15V/cm,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm,然后关闭电源。
3.从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板。
紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色
染色时间:
现温度下不少于2h。
脱色需3~10小时,期间应多次更换脱色液直至背景清楚。
为了永久性记录,应尽快对凝胶进行拍照。
4、实验结果与讨论
1、质粒的提取、酶切电泳图谱
M
2
1
图1-1第四组电泳图谱图1-2第三组电泳图谱
1:
酶切后的质粒2:
质粒M:
Marker1、2:
质粒4、5:
酶切后质粒
观察结果:
通过对比第三组和第四组电泳图谱,可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的前面,并且质粒泳道条带比较多;电泳条带模糊,呈凹凸形状,拖尾现象比较严重,不能很明显地观察结果。
原因分析:
(1)质粒泳道条带较多的原因可能是,质粒有的是超螺旋的,有的可能是开环质粒,还有的形成各种聚合物,因此呈现多条条带。
由于形成聚合物,分子量增大,因此条带在酶切条带的后面,条带最亮说明呈聚合状态的质粒的量是最多的。
(2)Marker条带模糊,拖尾现象严重可能的原因有:
电泳缓冲液最好现用现配,可以提高电泳效果;琼脂糖的浓度可能不是很适合,应尽可能摸索出该质粒最适浓度;电泳时电压不是最适电压,而且电压不是很稳,电泳时间太长,可能是电泳仪器太老化了;正确合适的上样量是条带清晰的保证,条带模糊可能是上样量太大;有时候可能是由于DNA被蛋白质或一些酶污染。
2、转化结果(培养基)
3、目标蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱
1)电泳检测样品包括:
蛋白Marker、上样液(原液)、上样后的穿透液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。
2)各个小组将100mM咪唑冲洗液在一块胶上一起电泳。
3)只有第二小组做了对照电泳,将未加IPTG诱导的菌液进行了相应的电泳。
图3-1目标蛋白的SDS-PAGE鉴定图谱
以Marker为临界线,右边是我们第四组的电泳图谱,左边是第三组的电泳图谱。
1:
破菌后的原液2:
50mM咪唑冲洗液3:
100mM咪唑冲洗液
4:
250mM咪唑冲洗液我们以第三组的穿柱液作为标本
2)我们从图谱中可以看出目标蛋白在50mM咪唑洗脱液和100mM咪唑洗脱液中被洗脱下的量是比较多的,因此我们可以在50-10mM之间寻找最适咪唑液的浓度。
3)图3-2是未加IPTG诱导目标蛋白产生的对照,通过与图3-1对比,可以发现在33kD-45kD之间没有蛋白条带的产生,而加IPTG的组有明显的蛋白质条带,因此可知在诱导外源基因表达时诱导剂是必不可少的。
五、实验总结
1)通过本次试验,学到了很多以前没有接触过的实验技术,也锻炼了一下以前学过的方法,更从实验中的小细节领悟到许多知识,总体来说收获很大。
2)在实验中要养成良好的习惯,不忽略任何小细节,加强时间观念,加强团队合作精神,及时纠正自己的不良操作规范,不懂得东西要及时请教他人。
3)最后,感谢三位老师的悉心指导,感谢第四组所有成员的共同努力,感谢所有同学在实验过程中对我们的帮助。
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