PCR实验注意事项.docx
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PCR实验注意事项.docx
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PCR实验注意事项
1.实验中的一些好习惯
2.加入试剂以前,把它混匀一下,省得搁置时间长了浓度不均
3.移液枪用完以后要归到最大计量的地点,防范长此过去弹簧失掉弹性
4.必定要记住关水浴箱,牢记牢记
5.多和大家谈论,同时多关注他人谈论的经验,这几乎是最快提升的捷径了
6.所有的试剂都自己配,出了问题才好找原由
7.防范RNA酶污染的措施
8.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
9.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:
有机玻璃用具因可被氯仿腐化,故不可以使用)。
3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂清洗,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在
10min,而后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。
3%H2O2
室温
配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃办理12hr以上。
而后用高压灭菌除掉残留的
DEPC。
不可以高压灭菌的试剂,应该用DEPC办理过的无菌双蒸水配制,而后经0.22μm滤膜过滤
除菌。
操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
设置RNA操作专用实验室,所有器材等应为专用。
二、常用的RNA酶克制剂
1.
焦磷酸二乙酯(
DEPC):
是一种激烈但不完全的
RNA酶克制剂。
它经过和
RNA酶的活性基团
组氨酸的咪唑环联合使蛋白质变性,从而克制酶的活性。
2.
异硫氰酸胍:
目前被以为是最有效的
RNA酶克制剂,它在裂解组织的同时也使
RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对
RNA酶有激烈的变性作用。
3.
氧钒核糖核苷复合物:
由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和
RNA酶联合形成过渡态类物
质,几乎能完好克制
RNA酶的活性。
4.
RNA酶的蛋白克制剂(RNasin):
从大鼠肝或人胎盘中提获得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA
酶的一种非竞争性克制剂,可以和多种
RNA酶联合,使其失活。
5.其余:
SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有必定克制作用。
因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和些缓冲液(比方Tri)不可以相容
RNA,所以在分别和纯化
RNA过程中不可以使用,并且它与一
在所有
RNA实验中,最要点的要素是分别获得全长的
RNA。
而实验失败的主要原由是核糖核酸酶
(RNA酶)的污染。
RNA酶可耐受多种办理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜伏污染源是研究人员的手。
所以进行
RNA实验时应勤换
手套。
但DEPC能与胺和巯基反应,因此含
(一)动植物总RNA提取-Trizol法
Tris
和DTT的试剂不可以用
DEPC办理
Trizol
法合用于人类、动物、植物、微生物的组织或培育细菌,样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点解析,斑点杂
交,Poly(A)分别,体外翻译,RNase封阻解析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总
体积不可以超出所用Trizol
体积的10%。
2、研磨液室温搁置
5分钟,而后以每
1mlTrizol
液加入
0.2ml
的比率加入氯仿,盖紧离心
管,用手激烈摇荡离心管
15秒。
3、取上层水相于一新的离心管,
按每
mlTrizol
液加
0.5ml
异丙醇的比率加入异丙醇,
室温
搁置
10分钟,12000g离心10分钟。
4、弃去上清液,按每mlTrizol液加入最少
1ml
的比率加入
75%乙醇,涡旋混匀,4℃下
7500g
离心
5分钟。
5、当心弃去上清液,而后室温或真空干燥
的溶解度。
而后将RNA溶于水中,必需时可
5-10分钟,注意不要干燥过分,不然会降低RNA
55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分别,或
储存于
70%乙醇并保存于
-70℃。
[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
别的,提取上清这步必定要当心,凑近积淀的部分必定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,
影
响比值
2、加氯仿前的匀浆液可在
-70℃保存一个月以上,
RNA积淀在
70%乙醇中可在4℃保存一周,
-20℃保存一年。
总mRNA的提取(自己的经验)
一、关于TrizolReagent
需要的试剂
1.Chloroform:
氯仿(
解析纯)
2.Isoproplylalcohol
:
异丙醇(解析纯)
3.75%Ethanol(inDEPC-treatedwater):
75%乙醇。
要求用解析纯无水乙醇并用
0.01%的DEPC
办理过的无Rnase的水稀释。
4.RNase-freewater
:
无Rnase的水。
方法是:
将
DEPC按0.01%(V/V)加在dH2O中500ml
(50ul),在37℃过夜,并高压灭菌即得(150℃3
小时)
5.一次性塑料手套
6.注意:
DEPC有致癌之嫌
二、关于TrizolReagent
的使用过程:
1.Homogenization
(匀浆)
a.Tissues:
组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol
试剂,样品体积不可以超出
Trizol
试剂的10%。
b.CellsGrowninmonolayer
(单层细胞接毒后出现病变的)
针对JEV细胞总RNA的抽提法:
BHK21细胞长成单层后,接毒0.5-1ml
(采纳大瓶),37℃吸附1h,倒掉,加保持液(含
2%的血
清和HEPE8的MEM)约5ml,保持天。
出现75%-100%的病变时,以
PBS(预冷)冲洗细胞两次,
直接在细胞瓶中加入
Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次,以裂解细胞(细胞瓶有两
种常用规格:
大的约45cm2,小的约30cm2,故所用Trizol试剂分别约为4.5ml
和3ml。
Trizol试剂的加入是
依细胞瓶而定,以盖满瓶
底为度,而不是依照细胞的数目,不然可以致
DNA的污染)详尽方法
以下:
(样品必定要新鲜)
(1)组织接入预冷的EP管中,加入
Trizol试剂1ml/10cm2(量必定要加足,不然易污染),
混匀,吹吸几次,以破裂细胞,置室温
5min,以使核蛋白复合物完全分别。
(2)加氯仿0.2ml
(每1mlTrizol
试剂加入氯仿
0.2ml),盖好,激烈震荡
15s,置室温2-3
分钟。
(3)4℃离心,10000g×15min,离心后,混杂物将分别为基层为浅红的、中层为酚
-氯仿相、
上层为无色的水相。
RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的
Trizol
试剂量的60%。
(4)仔细汲取上层水相,移至另一
EP管中。
(5)加0.5ml异丙醇,以积淀
RNA(每1mlTrizol
试剂加入0.5ml
异丙醇),置室温
10min。
(6)4℃离心,10000g×10min。
RNA积淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
(7)弃上清液,加入预冷的
75%乙醇1ml(每1mlTrizol
试剂加入75%乙醇最少1ml),震荡,
充分清洗积淀,4℃离心,5500g×5min。
弃上清液,空气干燥(或真空干燥)后,积淀重悬于无
RnasedH2O中,吹吸几次,55℃-60℃作用10分钟以溶解
RNA,-70℃保存备用。
(8)抽提出的细胞总
RNA干燥后加水50ul,取10ul加无Rnase水990ul,稀释100倍成1ml。
于0.5cm厚的石英比色杯中,以无Rnase水为比较,在721
型紫外分光光度计下检测,结果应为:
A260/280ratio<1.6
。
(9)分别组织10mg(纯组织)加800ulTrizol
试剂。
(10)扩增产物的判定
DEPC办理方法以下:
1.DEPC办理
(1)DEPC水:
100ml超纯水加入0.2mlDEPC,充分混匀,高压灭菌。
(2)Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包含1ml、200μl、
(20μlTip头;EP管和PCR反应管等):
用0.1%的DEPC水(1000ml超纯水加入1mlDEPC)37℃浸泡过夜,高压灭菌。
(提取RNA,用DEPC水溶解
(RT
(我是用PCR仪来控制温度和时间的,所以RT是在PCR反应管中作的。
(操作过程中要戴一次性手套,并常常换手套。
(最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水办理一下,枪头盒插好枪头后,加入1-2ml的0.1轕
(C水,在灭菌就行了;此刻有入口的RNASEFREE的枪头买,直接用不用办理的
(
(
(如何除掉污染
(机器运转完后,拿出PCR产物时不可以随意扔掉,应该用塑料手套或其余打结包好后丢入垃圾桶。
(1)试剂:
mixer尽量分装,不要原瓶多次取用。
(2)加样:
原则是DNA最后加,其余试剂依照体积大小从大往小的加。
假如是同种引物和探针
有多管的话不过DNA不一样,那么采纳的方法是算出整体积后加在一个管子里面,分装到各个管子里去,这样可以有效地防范偏差及污染。
混杂平均以后再
别的,一般实验室简单污染,
且污染程度很高,与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有
比较大的关系,最简单造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。
目前,国内外各个公司供给的诊断试剂盒大多采纳了UNG来防污染。
Uracil-DNAN-glycosylase(UNG)尿嘧啶DNA糖基酶,本源于大肠杆菌重组克隆表达。
RNA定量
RNA也最好最少要用电泳,一方面定量,另一方面可以看看完好性。
至于用分光光度计比较
不
同标本之间就更禁止了。
RNA的储藏,最主要的是温度,-
20不够,最好-
80,液氮最保险
mRNA是不可以取代蛋白水平的解析的,因为还有翻译效率和
RNA降解速度
的影响
RT-PCR有两种做法:
条件具备的话可用
kit
进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再
PCR。
但以后
发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是系统更加单一比较利于PCR
的进行
必定要做内参的,每一次,我想。
不作内参的结果是不行信的
电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,半定量和定量RT-PCR做的都是基因相
对表达量,不是绝对表达量
mRNA的分别与纯化中
步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育而后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏
RNA的
二级结构,特别是mRNAPoly(A
)尾处的二级结构,使Poly(A)尾充分裸露,从而提升Poly(A)RNA
的回收率;另一个目的是能解离
mRNA与rRNA的联合,不然会以致rRNA的污染。
所以此步骤不
能省略。
下边,我们介绍一个可以确认
RNA溶液中有没有残留的
RNA酶的方法。
3)保温试验
方法很简单的,按依旧品浓度,从
RNA溶液中汲取两份
1000ng的RNA加入至0.5ml
的离心管
中,并且用pH7.0的Tris缓冲液增补到10ul的整体积,而后密闭管盖。
把此中一份放入
70℃
的恒温水浴中,保温1h。
另一份搁置在-20℃冰箱中保存1h。
时间到了以后,拿出两份样本进行电泳。
电泳完成后,比较二者的电泳条带。
假如二者的条带一
致也许无显然差异(自然,它们的条带也要吻合方法
2中的条件),
则说明RNA溶液中没有残
留的RNA酶污染,RNA的质量很好。
相反的,假如70℃保温的样本有显然的降解,则说明
RNA
溶液中有RNA酶污染。
PCR污染与对策
)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常有的污染问题,所以,扩增区的仪器什么如枪优等要注意。
还有一种简单忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液风光摩擦时即可
形成气溶胶,在操作时比较激烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的频频吸样都可形
成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因此由其造成的污染是一个值得特别
重视的问题.
1标本办理区,包含扩增摸板的制备;
2.PCR扩增区,包含反应液的配制和PCR扩增;
产物解析区,凝胶电泳解析,产物摄影及重组克隆的制备。
各工作区要有必定的隔断,操作器材专用,要有必定的方向性。
如:
标本制备→PCR扩增→产物
解析→产物办理。
牢记:
产物解析区的产物及器材不要拿到其余两个工作区。
使用一次性吸头,禁止与
PCR产物解析室的吸头混用,
吸头不要长时间裸露于空气中,
防范气溶
胶的污染;
操作多份样品时,制备反应混杂液,先将
dNTP、缓冲液、引物和酶混杂好,而后分装,这样即
可以减少操作,防范污染,又可以增添反应的精确度
反应液污染
可采纳以下方法之一办理:
1.DNaseI
法:
PCR混杂液(未加模板和
Taq聚合酶)加入
0.5UDNaseI
,室温反应
30min
后
加热灭活,而后加入模板和
Taq聚合酶进行正常
PCR扩增。
该方法的长处是不需要知道污染
DNA
的序列;
(三)尿嘧啶糖苷酶(UNG)法
因为UV照耀的去污染作用对500bp以下的片段成效不好,而临床用于检测的
为300bp左右,所以UNG的预防作用日趋遇到重视和必定。
PCR扩增片段平时
1、提取
mRNA时所用的
EP管、玻璃等器皿所有都要用
0.1轕C水浸泡。
而后烘干,高压灭菌,
再烘干。
2、用DEPC水洗过后自然不可以用双蒸水洗了。
那你用
DEPC办理还有什么意义呢?
还要用双蒸水
洗吗?
3、玻璃器皿干烤:
180度,8小时或更长时间;小器皿也可以用少量氯仿办理一下。
别的,铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。
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