浅论Livin基因在非小细胞肺癌中表达的分子生物学特性.docx

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浅论Livin基因在非小细胞肺癌中表达的分子生物学特性

浅论Livin基因在非小细胞肺癌中表达的分子生物学特性

　　【关键词】Livin基因;非小细胞肺癌;分子生物学

　　原癌基因和抑癌基因所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜。

通过对原癌和抑癌基因蛋白结构和功能的分析，发现许多原癌基因和抑癌基因位于信号通路中的不同部位，参与许多重要的细胞活动过程，如细胞生长和分化、DNA复制和损伤修复、基因转录和表达、细胞周期调控等，在细胞凋亡、衰老过程中起重要作用，也在肿瘤的发生发展和转移中扮演重要角色。

Livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子（inhibitorofapoptosisprotein，IAP）家族的新成员之一，具有抗细胞凋亡作用，并明显地在肿瘤组织中特异性表达。

目前的研究表明，Livin基因在各系统的正常组织中很少表达，但在胚胎组织或发育组织、淋巴细胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种组织中广泛表达。

非小细胞肺癌的肿瘤细胞系中也有Livin基因的表达，但其与肿瘤的发生、转移、耐药性等之间的确切关系尚不清楚。

Livin基因特异性地表达于肿瘤组织，有可能成为NSCLC早期诊断的分子标志物，并为基因治疗提供新靶点［1-3］。

本文就Livin基因在NSCLC中的表达及其抗细胞凋亡作用、信号传导途径与调节机制等分子生物学特性作一综述。

　　1Livin基因及蛋白结构功能的多样性

　　IAP是一类重要的抗细胞凋亡因子，其共同的结构特征是N端含有一个或多个（最多为3个）串联的杆状病毒IAP重复序列结构域（baculovirusIAPrepeatsdomain，BIRs）和C端含有一个环指结构域（RINGfingerdomain，RING）。

目前已发现人类IAP家族有8个成员，即NIAP,XIAP（ILP1/MIHA），cIAP1（HIAP2/MIHB），cIAP2（HIAP1/MIHC），survivin（TIAP），apollon（Bruce），ILP2（TsIAP）和livin（MLIAP/KIAP）［2］。

　　Livin蛋白是IAP家族的一个新成员，一些实验室采用IAP同源序列（BIR或RING）寻找的方法，分别从人类基因组cDNA文库中克隆得到Livin核苷酸序列，从不同的组织中发现了Livin基因的表达。

Kasof等［3］在发育组织和肿瘤组织中发现并命名了Livin基因。

Lin等［4］从人胎肾cDNA文库中分离到该基因，故称其为KIAP。

Vucic等［5］发现Livin基因在G361和SKMel29两种黑色素瘤细胞源株中高表达，将其命名为MLIAP。

Ashhab等［6］发现了该基因存在2个剪接变异体，分别命名为Livinα和Livinβ。

同时，Lin等［4］用荧光原位杂交方法确定Livin基因位于人20号染色体区域，全长kb，包含7个外显子。

此外还发现存在长约,和kb的转录子，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，包含4个α螺旋和一个三股抗平行β片层，与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。

C端含有一个RING环指结构［4,6］，氨基酸残基C124,C127,H44及C151与锌原子结合，借以稳定整个重叠结构。

　　Livin蛋白有α和β两种变异体，分别由298和280个氨基酸组成，二者相差18个氨基酸，此区域由介于BIR和RING结构之间的第6外显子5′端54bp的基因序列编码。

Livin蛋白主要表达于胞质，但Kasof等［3］认为livin蛋白的细胞内分布与Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞质内呈丝状表达，同时也表达于胞核，并认为livin蛋白C末端的RING结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。

Livin基因mRNA3′端非翻译区多腺苷酸化与存在未剪接加工成熟的前体RNA有关，不同的剪辑有不同的变异体及亚型，这种结构基础有可能解释Livin基因蛋白存在多个结构功能。

如BIR结构域内单个氨基酸的突变就能发挥其抗凋亡作用，作者的实验也发现在A549细胞中表达的Livin蛋白缺少66个核苷酸的变异体，其确切的功能意义尚不清楚。

但Livin基因蛋白结构的变化与其功能的多样性存在明显的相关性。

　　2Livin基因在NSCLC中的表达

　　Livin基因仅在少数正常组织中表达，各家报道的研究结果存在较大差异，目前还不能确定Livin基因在人正常组织中的表达谱及其生理意义［2,7］。

Tanabe等［7］采用RTPCR法对15例正常肺组织和38例NSCLC组织作对比研究，发现LivinmRNA在NSCLC组织阳性率为%，正常肺组织阳性率为%，显示Livin基因在NSCLC中呈高表达，同时证明Livin基因与Survivin基因在NSCLC中的表达并不相关。

CrnkovicMertens等［1,8］同时采用NSCLC组织和NSCLC源HeLa细胞株培养检测Livin基因及其两种异构体Livinα和Livinβ的表达，结果显示Livinα和Livinβ在NSCLC中呈高表达。

采用RNAi技术分别使异构体基因沉默，发现Livinβ和Livinα基因的功能意义不完全相同，Livinβ在细胞凋亡中起关键作用。

国内崔肃等［9］采用RTPCR法检测NSCLC组织中LivinαmRNA和LivinβmRNA的表达，并用Westernblot方法分析Livin蛋白的表达，结果显示45例NSCLC组织中LivinmRNA表达阳性率为％，两种异构体基本同时表达，LivinβmRNA的表达量略高于LivinαmRNA。

而在癌旁正常肺组织和肺良性瘤样病变组织呈低表达，阳性率分别为％和％。

而且LivinmRNA表达阳性标本中均能检测到Livin蛋白表达。

陈淼等［10］采用免疫组织化学（SABC）的方法检测Livin蛋白在40例NSCLC组织以及12例正常和肺良性疾病组织中的表达，结果显示22例腺癌和18例鳞癌组织中的Livin蛋白阳性率分别为﹪和﹪，而正常肺组织和肺良性疾病组织均未检出Livin蛋白表达。

他们同时观察到不同分化程度NSCLC组织之间Livin蛋白的表达无显着性差异。

有和无淋巴结转移的肺癌组织中Livin蛋白表达的阳性率分别为﹪和﹪,两组的显着性差异标志着不同的生物学特性。

孙建国等［11］的研究结果显示，48例NSCLC组织中LivinmRNA表达阳性率为%，其表达与NSCLC组织学类型相关，腺癌中LivinmRNA表达阳性率达%，明显高于鳞癌和大细胞癌，而癌旁组织和肺良性疾病组织均未检出阳性结果，而且Livin蛋白表达与mRNA表达相一致。

研究还发现放、化疗后NSCLC组织中的Livin表达的阳性率为%，显着高于未放、化疗组织，提示放、化疗可明显诱导Livin蛋白的表达，这可能与临床上NSCLC对化疗药物和放疗耐受有关。

　　目前，Livin基因在NSCLC组织中特异性地高表达的现象已引起许多学者的关注［1２］，但LivinmRNA的表达与NSCLC患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期等的相关关系尚未完全阐明，Livin基因作为NSCLC的分子标志物，成为诊断和治疗NSCLC新靶点的可能性已引起人们的极大兴趣。

　　3Livin抗细胞凋亡作用及其调节机制

　　Kasof等［3,8］研究显示，Livin蛋白N端的羧基与Caspase3,7,9的直接结合，阻断了caspase发挥凋亡作用的途径，从而抑制了细胞凋亡的发生。

将Livin基因转染HeLa细胞，受转染细胞内由FADD,Bax,RIP,RIP3及DR6诱导的细胞凋亡可被有效阻断。

Vucic等［13］将Livin基因转染乳腺癌MCF7细胞，证实转染细胞对Fas,TNFR1,DR4及DR5介导的细胞凋亡具有显着的抑制作用。

许多化疗药物可导致肿瘤细胞DNA的损伤而诱导细胞凋亡，转染Livin基因的MCF7细胞可有效对抗阿霉素以及4TBP诱导的细胞凋亡。

但是各家报道Livinα和Livinβ蛋白的抗细胞凋亡作用存在一定差异。

Yang等［14,15］观察在JurkatT淋巴细胞株中，Livin基因可明显抑制由TNFα及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡，其抗细胞凋亡作用强于Bcl2。

Livinα对STS诱导的Jurkat细胞凋亡表现出一定的抑制作用，而Livinβ则无此作用。

CrnkovicMertens等［8］采用RNA干扰技术分别使内源性Livinα和Livinβ基因沉默，检测两者的抗凋亡作用，结果显示Livinβ可显着抑制依托泊苷和紫外线放射治疗等诱导的HeLa细胞凋亡，但Livinα则不明显。

更多的研究则认为Livinα和Livinβ基因均具有抗细胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途径有待进一步证实。

　　许多研究证实［12-16］，Livin蛋白介导细胞凋亡抑制存在不同的调节途径，通过与激活形式的Caspase3和Caspase7结合，抑制其活性。

Livin蛋白还可与未加工的或断裂形式的Caspase9结合，可抑制由Apaf1、细胞色素C及dATP诱导的Caspase9激活作用。

Livin蛋白与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livin蛋白与Caspase的结合作用的减弱或消失，致使Livin蛋白抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失，这也许可成为基因治疗的调节点。

Sanna等［12］的研究显示，Livin可激活MAP激酶JNK1和JNK2，但对JNK3无激活作用，而Livin蛋白对JNK1的激活作用远远强于JNK2，并且这是Livin蛋白对抗TNFα和ICE介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。

JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK7信号途径，而是通过TAB1/TAK1途径实现。

TAK1是MAP3激酶之一，在TGFβ1的刺激下TAK1可激活JNK1。

TAB1是TAK1的共活化因子，TAB1本身对于JNK1无激活作用，但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。

Livin蛋白可与TAB1结合，并进一步激活TAK1。

此外，Vucic等［13］证实SMAC及活性肽片段可与Livin蛋白的BIR结构域特异性结合，抑制Livin蛋白与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。

因此存在着由SMAC介导的对Livin蛋白抗细胞凋亡作用的负性调节机制。

　　4Livin基因治疗NSCLC的临床应用前景

　　鉴于Livin基因具有明显的抗细胞凋亡作用以及在肿瘤组织中的特异性表达，人们注意到其与肿瘤发生发展的关系，并开始探讨Livin用于肿瘤基因治疗的可行性。

应用基因转染技术可获得稳定表达Livinα和Livinβ的NSCLCA549细胞克隆。

孙建国等［17］用平板克隆形成实验研究A549细胞生长情况，用MTT法检测其对放、化疗的敏感性，用细胞周期分析法观察细胞凋亡情况。

结果发现转染Livinα和Livinβ基因后的细胞尤其是表达Livinα的A549细胞，克隆形成能力提高、倍增时间缩短，对多种化疗药物和放射线敏感性降低，10Gy放射线照射下仅有%细胞发生凋亡。

可见Livin基因参与NSCLC的发生发展，也可能是NSCLC细胞对放、化疗耐受的重要机制之一。

　　CrnkovicMertens等［18］利用基因转染和特异性小干扰RNA（siRNA）技术，在肺癌SPCA1细胞株中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系，观察诱导SPCA1细胞凋亡效应中的不同作用，并用TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。

结果显示内源性Livinα和Livinβ基因沉默后，SPCA1细胞克隆形成能力较对照组显着下降，促使SPCA1细胞发生凋亡，表明Livinα和Livinβ两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点，通过使Livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。

　　由于Livin基因仅在肿瘤组织表达而在正常组织极少表达，Yagihashi等［19］用ELISA法在肺癌患者外周血和肿瘤组织中均检测到自身Livin蛋白抗体，其组织特异性显而易见。

Hariu等［20］用Livin反义核苷酸片段刺激周围淋巴细胞，发现HLAA24与Livin7肽具有特殊亲和力，Livin蛋白表达阳性的NSCLC患者可检测到特异性细胞毒T淋巴细胞，而Livin蛋白表达阴性NSCLC患者则测不到CTLs。

结果提示Livin蛋白可成为NSCLC免疫治疗的靶点，将Livin7肽作为免疫制剂具有良好的应用前景。

　　综上所述，Livin基因是肿瘤细胞凋亡途径中的一个信号调节点，其在NSCLC组织中的特异性表达为NSCLC的诊断提供了新的分子标记物，亦可成为NSCLC治疗的新靶点［21，22］。

目前，人们已能在基因水平上干预因基因表达异常而导致的疾病，尤其是以mRNA为靶标的反义药物，可抑制和消除致病基因的表达，达到治疗的目点。

因此，采用反义核苷酸、小分子抑制剂和免疫介入等基因治疗手段直接阻断Livin蛋白与目的分子的结合，可以促使肿瘤细胞的凋亡，为NSCLC的治疗开辟新的途径［23，24］。

同时，对NSCLC患者肿瘤组织和外周血免疫细胞的Livin蛋白及其mRNA表达的联合检测，有可能成为NSCLC早期诊断、转移风险和预后的分子标记物。

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