4西南大学网络与绩效教育学院《园艺植物离体培养》作业及答案.docx

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4西南大学网络与绩效教育学院《园艺植物离体培养》作业及答案

《园艺植物离体培养》作业及答案

第一批作业及答案

名词解释：

1、外植体：

用于组织培养（离体培养）的植物材料，如根、茎、叶、花药、胚珠等。

4.细胞全能性：

一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，植物细胞在适宜条件下具有发育成完整植株的潜在能力。

5.胞质杂种：

所谓胞质杂种（Cybrid）是指一个物种的细胞质（不包括核基因组）基因与另一个物种的细胞质和胞核基因融合为一体的体细胞杂种产物。

填空题

6.培养基一般采用（湿热）灭菌。

1.连续培养有 开放式连续 培养和 封闭式连续 培养两种方式。

1.侵染性病害又根据病原生物的类别分为5类，即：

（真菌病害）、（细菌病害）、（病毒病害）、（线虫病害）和（寄生性植物病害）等。

2.按照传播方式，植物病害可以分为（气传病害）、（土传病害）、（虫传病害）、（种苗传播病害）。

简答22.简述单细胞培养的方法。

答：

在单细胞培养中，常采用的基本培养方法有看护培养，微室培养和平振培养等几种，它们各有特点，可根据条件和需要选择使用。

1.看护培养法：

看护培养法是指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的培养方法，这个愈伤组织块称为看护愈伤组织。

这个方法最初是由Muir等（1953）设计的，当时是为了由烟草和金盏花细胞悬浮液和易散碎的愈伤组织中取单分裂的离体细胞，在看护愈伤组织的影响下则可能发生分裂。

由此可见，看护愈伤组织不仅给这个细胞提供了培养基中的营养成分，而且还提供了能促进细胞分裂的其他物质。

这种细胞分裂因素可通过滤纸而扩散。

愈伤组织刺激离体细胞分裂的效应，还可通过另一种方式来证实，把两块愈伤组织置于琼脂培养基上，在它们周围接种若干个单细胞，结果可以看到首先发生分裂的都是靠近这两块愈伤组织的细胞。

2.微室培养法：

微室培养法是指在无菌小室中培养接有单细胞的液体培养基小滴，使细胞得以生长和增殖成单细胞无性系的无菌培养方法。

它是为进行单细胞禁用词语连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。

微室培养的优点是便于在培养过程中连续进行显微观察，可以把一个细胞生长、分裂、形成细胞团的全过程记录下来。

同时它所用的设备，用具比较简单。

缺点主要是培养基数量少，因此水分难以保持，培养基中养分及pH值易于变动，多数细胞经短期休眠后往往即不再生长。

3.平板培养法：

平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底部的培养方法，此法是Bergman在1960年首创的，它是为分离单细胞无性系，研究其生理生化和遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。

广泛应用于细胞，原生质体及融合产物的培养。

在平板培养的整个过程中，必须注意以下几点：

A、选用的培养基，无论是条件培养基或是合成培养基，主要的一点，是通过在低的细胞起始密度下使细胞生长。

B、不要选取处于静止期的细胞，因为处于分裂旺盛时期的细胞有最高的植板率。

C、在固体培养基中适宜的起始密度因植物种类而不同。

如烟草细胞的适宜密度为0.5-1.0×104个细胞/ml，若低于此数，植板率显著下降。

D、接种细胞时固体培养基的温度要控制，一般认为不超过35℃，但也有人认为只要不超过40℃即可。

总之，温度低对细胞伤害少，但操作困难，容易引起部分凝固而使细胞分布不均匀。

故要求操作迅速（最好环境温度也在25-30℃）。

E、宜在黑暗或光强很低的条件中培养。

根据一些实验室的经验，在培养期间经常用显微镜在光下观察的反板，与一直在黑暗中增养的平板比较，其细胞群落的形成会受到一些抑制。

此外，为了提高植板率，还可以将一块植物组织与单细胞一起放到培养皿内的平板上，来提高植板率。

具体做法是：

在培养皿放几只玻璃环，环外是一般的平板增养，接种较低起始密度的单细胞。

环内接入一块愈伤组织，让它起看护组织的作用，其代谢产物可以通过琼脂扩散到环外去，从而促进环外单细胞的分裂生长。

判断题

14、通过愈伤组织形成的植株不易产生变异。

（错）

16、生根培养基中必须加入较高浓度的细胞分裂素。

（错）

18、原生质体融合也叫体细胞杂交。

（对）

21．简述花药培养的程序。

答：

（1）材料选取：

花药接种前一般需预先用醋酸洋红，I-KI溶液或浮尔根等染液进行压片镜检，以确定花粉的发育时期，并拭出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小，颜色等特征之间的相应关系。

一般而言，以单核中、晚期的花药进行培养是目前培养成功的主要时期。

据颜昌敬统计的13种作物，其中有11种作物适宜单核期。

（2）预处理：

（1）低温预处理；

（2）变温处理；（3）离心预处理  ；（4）乙烯利预处理。

（3）消毒：

花药培养时，材料的表面消毒通常比较方便，因为未**的花蕾中的花药为花被所包裹，本身处于无菌状态之中。

花蕾或幼穗的表面消毒一般用70%酒精在表面擦拭或浸一下后，在泡和漂白粉上清液中浸10-15分钟，或用0.1%HgCl2消毒7-10min，然后用无菌水冲洗3-5次即可。

在操作熟练的情况下，也有仅用70%酒精将花器表面擦净即取花药的，消毒时间一般不宜过长，否则消毒剂渗入花蕾内，如花药接触药剂，又冲洗不净，会影响培养后的生长。

（4）接种：

取出花药应在无菌条件下进行，在取花药时，应注意解剖器具尽可能不碰或少碰花药，以免受伤。

接种时花药要直接接触培养基，如果花丝牵着花药，不让它沿着培养基，则花粉就不会生长；同时，花丝在培养基上的生长会抑制花粉的分裂增殖，接种时速度要快，尽量减少花药在空气中的停留的时间，取出花药后直接投入培养基也很好。

直径3cm的试管，每管接种30-60粒。

（5）脱分化培养：

接种后放入培养室，温度通常为25-28℃。

脱分化要根据材料不同，选取基本培养基和适当生长素浓度进行培养，经10-30天可诱导愈伤组织形成。

（6）再分化培养：

愈伤组织增殖到1-3mm大小时，应及时进行再分化培养，以获得花粉植株。

这时要选择适当激素种类和水平的培养基上进行培养，约经20-30天，就能诱导苗的分化。

（7）花粉植株移植：

当花粉植株的根系生长良好时，就要及时炼苗并移至苗床或大田。

由于这是一个由异养到自养的转变过程，必须细心料理，保持幼苗的水分平衡和促进新根的发生。

（8）染色体加倍：

当单倍体植株产生后，应在适当的时期通过人工方法进行染色体加倍。

常用的方法是用0.02-0.4%秋水仙素处理。

双子叶植物处理生长点，禾本科植物在分蘖期处理。

第二批作业及答案

名词解释：

1、继代培养：

在组织培养中，培养物培养一段时间后，为了防止培养的细胞团老化，或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累毒害等的影响，要及时将其转接到新鲜培养基中进行培养。

2、胚状体：

指在组织和细胞培养中产生的在形态结构上与合子胚相类似的结构。

对称体细胞胚，简称体胚。

3、原生质体：

就是除去细胞壁后的裸露细胞，经分离纯化的原生质体作为外植体，在适当的培养基和培养条件下进行组织培养的方法。

4、体细胞杂交：

或称原生质体融合，是以植物体细胞原生质体为亲本进行融合而获得杂种后代的一种细胞工程技术。

5、愈伤组织：

是一团没有分化的可以持续旺盛分裂的细胞团，是组织培养过程中出现的一种组织形态。

有致密和疏松两类之分。

判断题

13.接种室常用的消毒剂是0.2%的HgCl2。

正确

14.培养室的温度常控制在25℃左右。

正确

15.茎尖培养可以达到脱毒的目的。

正确

16.脱毒苗不等于抗病毒苗。

正确

17.DMSO是较常用的冷冻保护剂。

正确

18.酶的灭菌多采用过滤灭菌。

正确

19.人参皂苷可以通过大规模的细胞培养产生。

正确

20.离体培养和组织培养是相同的意思。

正确

填空题

6.原生质体融合的主要方法有化学融合法；物理融合法。

7.培养室的光照因子有光照强度 、 光照时间 、光质 三个方面。

8.消毒剂HgCl2常用的浓度是0.1-0.2%。

9.离体培养中最常用的生长素是____NAA____。

10.离体培养中最易诱导愈伤组织的生长素是____2、4—D_。

11.形态发生的途径有__器官__发生和__胚胎__发生两条主要途径。

12.母液的配制可减少____称量的误差___，也可减少___工作量_______。

21.超低温保存有哪几个主要环节？

答：

植物种质资源的超低温保存技术，应把握以下一些重要环节：

1、外植体的选择与处理

（1）茎尖，愈伤组织，悬浮细胞，花粉，胚等器官或组织均可作为超低温贮存的材料。

材料应选择幼龄的组织细胞，因其胞质稠密，抗冻力强。

取材以冬天生长的植株为宜。

（2）一般来讲，在贮存前，为提高组织细胞的抗寒能力，往往应对外植体进行预培养和低温处理。

预培养一般需7-12天，培养基中加入能提高抗寒力的物质如山梨糖醇，ABA（脱落酸），或增加糖浓度等。

低温处理的方法是将外植体放在2-3℃低温下锻炼数天，处理后可明显提高材料的抗冻力。

超低温处理前，还必须进行冷冻保护剂处理。

其方法为：

先将保护剂预冷至0℃，等体积与培养基混合，静置30-60min。

这是因为DMSO等保护剂有毒，所以必须在0℃下处理，而且处理时间不宜过长，一般不超过1h。

2、降温冷冻

材料经冷冻保护剂预处30-60min以后，应立即降温冰冻，最后达到液氮低温保存。

从0℃到-196℃的降温过程，通常有三种方法：

（1）快速冰冻法：

将保存材料从0℃（或其他预处理温度）直接投入液氮中。

此法适于那些高度脱水的植物材料如种子、花粉、球茎或块根等。

一些抗寒木本植物的枝条或冬芽，经过冬季的细胞外结冰充分脱水后，也可采用此法。

此外，不少植物的茎尖组织保存用此法也有成功的报道。

快速冰冻的原理在于：

利用超速冷冻，可使细胞内的水迅速通过冰晶生长的危险温度区（-10~-140℃），使细胞内水分还未来得及形成冰晶中心，就降到-196℃的安全区，此时细胞内的水为玻璃化状态，该状态时细胞结构不产生破坏作用，从而减轻或避免细胞内结冰的危害。

例如，杨文（1999）在研究香雪兰愈伤组织超低温保存时，发现其最佳的冷冻程序是直接从0℃投入到液氮的快速冷冻法。

（2）慢速冰冻法：

在冰冻保护剂存在下，以每分钟下降0.1-10℃的速率降温进行冰冻。

在这种降温速率下，可通过细胞外结冰，使细胞内的水减少到最低限度，从而达到良好的脱水效应，此法需要程序降温仪，技术系统昂贵，但对许多不抗寒的植物保存却能带来成功。

（3）两步冰冻法：

第一步用慢速降温法降到-50～-30℃左右，使细胞达到保护性脱水状态；

第二步投入液氮中迅速冰冻。

3、化冻（解融）方法

化冻（或解融）是再培养能否功的关键。

升温给细胞带来的伤害至少与降温伤害同等重要。

目前常用以下方法化冻：

（1）快速化冻法

将样品直接放在37℃水浴化冻。

优点是可使样品快速地通过刚刚低于融点这一特别容易引起伤害的温度危险区。

但也有例外，对于缓慢降温到-80℃的胚来说，相对较低的升温速率（每分钟20℃）常带来较高的存活率。

（2）慢速化冻法

在0℃下，2-3℃或室温下进行化冻。

如木本植物的冬芽在0℃下化冻可获得最高的存活率。

这是因为冬芽在秋冬低温锻炼以及慢速冰冻的过程中，细胞内的水已最大限度地流到了细胞外结冰。

如果快速化冻，则细胞在化冻吸水时会受猛烈的渗透冲击，从而引起细胞膜的破坏。

4、生活力及存活率的测定

对解融后的材料，必须检测其生活力水平及存活率。

常见的方法有三：

（1）再培养：

即化冻后，将外植体转移到新鲜培养基上培养，观察其生活力。

这是最可靠的检查法。

考察的项目包括细胞增生能力与数量，愈伤组织形成能力与生长量，再生植株的分化能力等。

存活率是检测保存效果的最好指标。

（2）双酯酸荧光素（FDA）染色法：

用于悬浮细胞材料，以荧光素染料一滴，与等体积化冻后的细胞悬浮液混合后于荧光显微镜下观察记载，只有生活细胞才表现荧光。

（3）TTC法（氯化三苯基四氮唑还原法）

其原理在于测定细胞内脱氢酶活性。

许多实验证明，TTC法作为细胞损伤的一种初步鉴定手段是可靠的。

5、冰冻保存的基本操作程序，具体的技术处理和指标可以根据不同材料加以适当修正。

植物细胞全能性和在离体培养中的理论与实践意义。

22.植物细胞全能性和在离体培养中的理论与实践意义。

答：

植物细胞全能性是指：

一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，植物细胞在适宜条件下具有发育成完整植株的潜在能力。

利用植物细胞全能性这一理论，可以进行植物离体培养研究。

广义的讲包括：

植株培养、胚胎培养（Organculture）、器官培养（Organculture）、组织培养（tissueculture）：

、细胞培养（singlecellculture）、原生质体培养（protoplastculture）等。

概括起来，可将植物组织培养的意义分为理论和实践方面：

（1）在基础理论方面

①这一培养技术具有在自然条件下不能达到的无菌离体，以及能够严格控制环境因素等优点，因此能用于研究植物各种细胞、组织和器官所需要的条件以及生理生化上的特点。

②在细胞小平上研究诱变、筛选等遗传操作。

③可以为酶调节机制，细胞发育机制，器官发展胚胎发生的细胞学，遗传机制和生化过程的研究提供极其有用的材料和独特的方法。

④为优质、高效保存种质资源担保共了良好的条件。

⑤研究植物生产物的形成过程以及定性，定量分析等可以完全避免其他因素的干扰。

（2）在实践应用上

①利用花粉到花药培养获得的单倍体可通过加倍快速获得纯合体。

②远缘杂交的胚胎培养和试管受精获得远缘杂种植株来创造新的资源。

③优良品种的快速无性繁殖，亲本材料的快速繁殖等，可以加快新品种的推广和加速新品种的应用。

④通过分生组织培养获得脱毒菌。

⑤某些药物和次生代谢产物的工业化生产。

从以上可以看出组织培养在作的基础和应用的多方面都有重要的意义。

所以，有的科学家指出：

如果一旦成功地建立了一个良好的培养系统，则能获得在恒定条件下进行试验而排除季节以及其他各种生态因子变化的干扰，为取得理想的成果创造了优越的条件。

第三批作业及答案

判断题

13.茎段培养也是细胞培养。

 错误

14.器官培养主要是用于离体受精。

错误

15.经HgCl2消毒后的材料不要灭菌水冲洗。

错误

16.根部细胞不具备细胞全能性。

错误

17.光质对组织培养没有什么影响。

错误

18.为了诱导根的发生在培养基中主要应加BA。

错误

19.所有的细胞分裂素都是天然存在的。

错误

20.愈伤组织没有明显的结构。

错误

填空题

6.二倍体植株花粉培养可以获得____单___倍体植株，胚乳培养可以获得____三____倍体植株。

7.__Haberlandt___创造性地提出了细胞全能性观点。

8. 胚状体必须具备__两_极性，不定芽具备____单__极性。

9.培养室的温度一般控制在______25_____℃左右。

10. 生根时要求无机离子浓度较____低______。

11.子房培养的主要目的是___试管授精_______。

12. 二倍体子叶离体培养产生的植株是___二___倍体。

名词解释

4、植物生长调节物质：

对植物外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化，起着重要的调节作用。

包括生长素类（IAA、NAA、2，4-D等）、细胞分裂素类（ZT、KT、BA等）、以及赤霉素、脱落酸等。

5、无菌操作：

在超净工作台中，切割植物材料、接种外植体等，尽可能避免细菌、真菌的污染的操作过程。

简答题

21.组织培养中，琼脂起什么作用?

答：

组织培养中，琼脂的作用：

①凝固培养的作用②支撑外植体和植物培养材料的作用③固体培养基使用的琼脂的浓度一般为每升培养基添加琼脂7克左右。

④琼脂可以用卡拉胶替代。

22.培养基、培养器皿和植物材料通常怎样灭菌?

答：

①培养基一般采用湿热灭菌，即在高压灭菌锅中，121℃灭菌18—25分钟。

②培养器皿可以采用湿热灭菌，也可以采用干热灭菌，即烘箱高温灭菌或者酒精灯火焰灼烧，③植物材料在消毒前用自来水冲洗干净，然后可以用0.1—0.2%升汞消毒8-10分钟，或者用次氯酸钠溶液消毒。

也可在植物材料消毒之前用70%的酒精消毒30秒左右，再用升汞或次氯酸钠消毒。

如果植物材料表面有绒毛，可以在消毒时添加1-2滴吐温。

消毒过程在超净工作台上完成，消毒后用无菌水冲洗4-6次。

第四批作业及答案

名词解释

1、茎尖培养：

是切取茎的尖端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。

2、花药培养：

将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，放在无菌的条件下，使其进一步生长、发育成单倍体细胞或植株的技术。

3、离体胚培养：

在离体条件下创造人工营养环境，对发育程度不同的胚进行培养的技术，一般包括成熟胚培养和幼胚培养两种类型。

4、子房培养：

离体条件下子房的无菌培养技术，子房既可是已授粉的，也可是未授粉的。

5、试管受精：

在人工控制条件下，使离体的胚珠或者子房完成授粉、受精形成种子的过程。

填空题

6.一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象称为"__脱分化_"。

8.原生质体的分离有___机械法__和__酶解法__两种方法。

9.植物组织培养过程中，最常用的培养基是 MS ，培养基的pH因外植体的来源不同而异，常用 HCL和 NaOH 调节pH，大多数植p要求调节在 5.6～6.0范围内。

12．组织培养植株的再生途径有两条：

一是器官发生，另一是 胚胎 发生。

7. 愈伤组织的形态发生有__致密__和__疏松__两种情况。

10.可以通过 适宜外植体 、最佳的培养基、连续转接 、 加抗氧化剂、加活性炭等措施预防褐变的发生。

11.植物组织培养时，外植体可以是 器官、组织、细胞、 去掉细胞壁的原生质体。

1、悬浮细胞培养：

是指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行无菌培养的技术，它是从愈伤组织的液体培养技术基础上发展起来的一种新的培养技术，此项技术目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐大规模工业生产的连续培养。

　　2、成批培养：

指在含有固定体积培养基的容器系统中的培养。

它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。

　　3、连续培养：

是指在培养过程中不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充和保持其恒定体积的培养。

　　4、植板率：

是平板培养中常用的一个术语，是用来反映植板效率高低的一个数值，其含义是已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分比。

判断题

15.未成熟胚较小，易培养；成熟胚较大，不易培养。

错误

16.MS培养基无机盐浓度低，适合生根培养。

错误

17.由性细胞发育而成的胚叫做胚状体，而由体细胞发育而成的胚叫做合子胚。

错误

19.经过花药培养所获得的植株都是单倍体。

错误

20.二倍体细胞比单倍体细胞容易诱导愈伤组织。

错误

二、问答题

　　１、请用图简要表示原生质体分离和培养的技术流程。

　　参考答案  

２、原生质体融合后，杂种细胞可以采用哪些方法进行选择？

　　答：

（1）利用或诱发各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选出来。

细胞互补包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补、抗性互补等。

前两种为隐性性状，后一种为显性性状，其互补原理是一致的。

（2）利用或人为地造成两个亲本间原生质体的物理特性差异，从而选出杂种细胞。

原生质体的物理特性，例如，大小、颜色、漂浮密度等也可作为选择的依据。

对于不具备物理差异的原生质体，可以人为的进行处理以便选择。

（3）利用或人为地造成细胞生长或分化能力的差异，从而进行选择。

原生质体的植株再生能力是广泛应用的选择依据。

在种内、种间与属间的体细胞杂交实验中，只要亲本一方能再生植株，杂种细胞就能再生植株。

因而可将原生质体的再生能力看作为显性性状，用来淘汰无再生能力的一方亲本。

与其他选择方法相结合，将能再生的一方亲本淘汰，就可以选出杂种植株。

实际上，以上这三类方法在应用时往往相互配合，具体做法需视实验对象而定。

　　３、原生质体酶法分离主要会用到哪些酶，酶法分离原生质体又可分成哪两种方法？

　　答：

植物细胞外包裹着一层由纤维素,半纤维素和果胶物质等组成的细胞壁,它直接妨碍着原生质体的培养及其融合。

要使植物细胞壁降解释放出原生质体，必须使用能催化纤维素，半纤维素和果胶物质水解的酶制剂，最常用的有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

　　酶法分离原生质体有顺序法和直接法两种。

顺序法又称二步法，即先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。

直接法又称一步法，即用果胶酶和纤维素酶等混合处理材料，为目前最常用的方法。

　４、原生质体培养有哪些常用方法？

用哪些方法可以实现原生质体融合？

　　答：

培养方法可以分为固体培养法和液体培养法两大类，后来又由此派生出一些不同形式的原生质体培养方法。

常用的有液体浅层培养法、固体平板法、悬滴培养法等。

原生质体融合有自发融合、诱导融合。

其中诱导融合的方法有：

硝酸钠法、多聚化合物法、高pH高Ca++法、聚乙二醇法、还有电融合等方法。