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药物在大鼠主动脉组织及其培育细胞的细胞膜色谱研究
药物在大鼠主动脉组织及其培育细胞的细胞膜色谱研究
【摘要】目的比较细胞膜色谱法中细胞膜固定相的特异性。
方式别离构建大鼠主动脉组织匀浆细胞膜固定相和培育大鼠主动脉滑腻肌细胞膜固定相。
用细胞膜色谱法研究10种αAR兴奋剂和拮抗剂的生物亲和作用,测定其容量因子并进行相关性分析。
结果10种药物在大鼠主动脉组织和培育大鼠主动脉滑腻肌细胞膜固定相上容量因子之间存在正相关关系,相关系数r=,有极显著性意义(P<。
结论用培育的细胞制备细胞膜固定相具有更高的特异性,可提高药物的保留时刻,也可用于药物的高效初筛。
【关键词】细胞膜色谱α肾上腺素受体
ABSTRACT:
ObjectiveTocomparethespecificitiesofthecellmembranestationaryphases(CMSP)withcellmembranechromatography(CMC).MethodsCellchromatographiccolumnswereconstructedforbothrataortatissuecellsandculturedrataortasmoothmusclecells.Thenthechromatographicaffinitiesoftenligandsofαadrenergicreceptor(αAR)withbothsaidchromatographiccolumnswereinvestigated.Capacityfactors(k'),asachromatographicparameter,werecalculated.ResultsThecorrelationanalysisshowedapositivecorrelationbetweentherataortatissueCMSPandtheculturedrataortasmoothmusclecellCMSP,withcorrelationfactorofr=,P<.ConclusionByimprovingthespecificitywiththeCMSPofculturedrataortasmoothmusclecell,theenhancedCMCmethodiscapableofaffinitiesforevaluatingligandreceptorsordrugscreening.
KEYWORDS:
cellmembrane;chromatography;αadrenergicreceptor
细胞膜色谱法(cellmembranechromatography,CMC)是研究受体与药物彼此作用的新型亲和色谱技术,将高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学相结合,利用药物与膜受体间存在的特异性亲和力,成功地将药物体内的作用进程在色谱柱内进行动态模拟[14]。
CMC法与放射性配体结合法和受体功能分析方式的相关性研究证明,三种方式取得的配体及其异构体对M、α、β受体亲和力顺序大体相同,并具有明显的相关性[57]。
为了研究组织器官和培育细胞制备的细胞膜固定相(cellmembranestationaryphrase,CMSP)的异同,本次实验将CMC法与细胞生物学方式相结合,用大鼠主动脉组织和其培育细胞CMC法研究了10种不同αAR兴奋剂与拮抗剂的生物亲和作用。
比较了传统的CMC法(CMSP为组织细胞膜)与改良后的CMC法(CMSP为培育细胞)的特异性和相关性。
成立了大鼠主动脉滑腻肌培育细胞的CMC模型。
1材料与方式
药品和试剂羟甲唑啉(Oxymetazoline、5甲基乌拉地尔(5methylurapidil,5MU购自RBI公司;RS17053(449)购自RocheBioscience;去甲肾上腺素(Norepinephrine、哌唑嗪(Prazosin、酚妥拉明(Phentolamine、苯肾上腺素(Phenylephrine、甲氧明(Methoxamine、育亨宾(Youhimbin、BMY7378购自Sigma公司。
DMEM干粉培育基(GIBCO公司)、小牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、NaCl、盐酸(HCL)、磷酸(H3PO4)、乙醇(C2H5OH)等均为国产分析纯。
实验动物SD大鼠3只,体重100-150g,雌雄不拘,年龄2-3个月。
由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
仪器Gilson高效液相色谱系统,包括370泵、115型紫外检测器、7725型手动进样阀(美国Rheodyne公司)和Anastar色谱工作站(奥泰科技);HERMLEZK410型低温冷冻高速离心机(德国);AS5150A超声振荡仪(AutoScience公司);PHS2D型酸度计(上海第二分析仪器厂);ShimadzuTB85型循环水浴(瑞士)。
方式
大鼠主动脉组织细胞膜制备取两只SD大鼠,颈椎脱臼处死,迅速开胸,掏出主动脉,置于冷的生理盐水中,清洗数次,洗净余血,用锋利眼科剪除去主动脉壁周围的脂肪及结缔组织。
将主动脉在匀浆管中剪碎,加入10倍量冷生理盐水,制备匀浆。
制得的匀浆在400×g离心10min,弃去沉淀,上清液10000×g离心10min。
沉淀再以生理盐水反复洗涤离心,直至沉淀为均匀的乳白色,然后加入必然量的低渗液,超声振荡20min,12000×g离心10min,弃去上清液,沉淀即为所需主动脉细胞膜。
上述操作均在0-4℃下进行。
大鼠主动脉组织色谱柱的制备取经活化处置的硅胶,作为细胞膜的载体置于低温反映管中,在抽真空和震荡条件下,别离加入上述细胞膜悬液,反映1h后,加入适量生理盐水稀释,在25℃条件下,使细胞膜磷脂双层自融合,直至在硅胶载体表面形成均匀的细胞膜。
低速离心除去上清液,载体细胞膜用TrisHCL缓冲溶液洗涤,除去未结合的细胞膜。
培育的大鼠主动脉滑腻肌细胞膜的制备大鼠主动脉滑腻肌细胞原代培育[89]采纳组织贴块法。
取SD大鼠,颈椎脱臼处死,在无菌环境中迅速剪取胸主动脉,移入盛有无菌培育液的平皿中。
用眼科剪子将动脉纵行剖开,内膜面向上,用眼科小弯镊轻轻刮去内皮细胞,用钟表镊细心撕下中膜的内中层,使其成1mm×1mm左右的血管片,用滴管移入事前铺好血清的培育瓶内,均匀种植。
放入37℃CO2培育箱中4-6h后将培育瓶翻转,加入4mL含20%(体积分数)小牛血清的DMEM培育液,使组织块浸入培育液中,静止5d。
10d后可见细胞从植块边缘萌出。
待20d左右细胞融合成片长满瓶底。
用L%)胰蛋白酶和L%)EDTA混合消化液,按常规方式消化。
终止消化后放入含少量小牛血清的离心管中离心(1000×g离心8min)。
倾去上清液,添加适当培育液吹打后分瓶,5d左右细胞长满瓶底,再次依法作传代培育。
实验采纳第3-5代血管滑腻肌细胞。
当细胞覆盖瓶底50%时,可将细胞掏出制膜。
将消化好的细胞悬液在1000×g离心10min。
弃去上清液,加入必然量的低渗液,超声振荡20min,400×g离心10min。
弃去沉淀,上清液12000×g离心10min后,沉淀既为所需细胞膜。
大鼠主动脉滑腻肌细胞色谱柱的制备大鼠主动脉滑腻肌细胞色谱柱用上述的培育细胞的细胞膜制备(方式同。
10种αAR配体在两种CMSP上的亲和力 色谱条件:
柱温为37℃,流速为min。
用pH=的50mmol/L磷酸盐缓冲液作为流动相,平稳3-4h后,将药物别离添加到流动相中进样分析(紫外检测波长为220-280nm)。
2结果
10种αAR配体在CMSP上的亲和力用50mmol/L磷酸盐缓冲液别离平稳大鼠主动脉组织及其培育滑腻肌细胞膜色谱柱3-4h后,依照每种药物的紫外检测波长测定结果进样分析。
药品均用三蒸水溶解,质量浓度均为1g/L,每种药物别离进样3次,取平均值后计算不同药物在主动脉组织CMSP上的容量因子k'(表一、表2)。
表1药物在大鼠主动脉组织CMSP上的色谱作用参数(略)
Table1ChromatographicparametersofthedrugsonrataortatissuecellsCMSPcolumn
capacityfactorswerecalculatedfromk'=(tR-t0)/t0,wheretRisretentiontimeofligands,t0isretentiontimeofsolvent.CV=s/×100%;CMSP:
cellmembremestationaryphase;BMY7378:
(8[2[4(2methoxyphenyl)1piperazinyl]ethyl]8azaspirol[]decane7,9dione);RS17053:
(N[2(2cyclopropylmethoxyphenoxy)ethyl]5chloroα,αdimethyl1Hindole3ethanaminehydrochloride)
表2药物在大鼠主动脉滑腻肌细胞膜CMSP上的色谱作用参数(略)
Table2ChromatographicparametersofthedrugsonculturedrataortasmoothmusclecellsCMSPcolumn
Capacityfactorswerecalculatedfromk'=(tR-t0)/t0,wheretRisretentiontimeofligands,t0isretentiontimeofsolvent.CV=s/×100%;CMSP:
cellmembremestationaryphase;BMY7378:
(8[2[4(2methoxyphenyl)1piperazinyl]ethyl]8azaspirol[]decane7,9dione);RS17053:
(N[2(2cyclopropylmethoxyphenoxy)ethyl]5chloroα,αdimethyl1Hindole3ethanaminehydrochloride)
在实验所用不同的αAR兴奋剂和拮抗剂中,酚妥拉明为非选择性α受体拮抗剂;哌唑嗪为α1选择性拮抗剂,对α2的作用很弱,亲和力为α1的1/1000;5甲基乌拉地尔、RS17053为α1A受体选择性拮抗剂;BMY7378为α1D受体选择性拮抗剂;去甲肾上腺素为α受体兴奋剂;甲氧明为α1受体兴奋剂;苯肾上腺素为α1受体兴奋剂;育亨宾为α2受体拮抗剂。
由表一、表2可见,药物在大鼠主动脉组织细胞CMSP上的保留时刻由长到短依次为:
哌唑嗪、5MU、酚妥拉明、BMY737八、羟甲唑啉、RS17053、育亨宾、甲氧明、去甲肾上腺素、苯肾上腺素。
容量因子别离为:
、、、、、、、、。
用培育主动脉滑腻肌细胞制备的CMSP取得的αAR兴奋剂和拮抗剂的亲和力顺序由大到小别离为:
哌唑嗪、酚妥拉明、5MU、羟甲唑啉、BMY737八、育亨宾、甲氧明、苯肾上腺素、去甲肾上腺素、RS17053。
容量因子别离为:
、、、、、、、、、0。
药物在两种CMSP模型上的容量因子(k)相关性的比较相关分析说明:
药物在大鼠主动脉组织、培育大鼠主动脉滑腻肌细胞CMSP上容量因子之间存在正相关关系,相关系数r为,相关系数有极显著性意义(P<。
3讨论
本次实验研究了αAR兴奋剂和拮抗剂在大鼠主动脉组织细胞和其培育细胞制备的CMSP上的亲和力。
成立了大鼠主动脉滑腻肌细胞CMC模型。
除药物RS17053在主动脉组织上的亲和力强于培育的主动脉滑腻肌细胞之外,其余药物在这两种CMSP上的整体趋势是一致的。
培育的主动脉滑腻肌细胞是主动脉血管的中膜部份,不仅纯化了细胞,而且不含有内皮细胞。
可能是RS17053与主动脉内皮细胞上多种受体的亲和力较强。
说明用组织器官和培育细胞制备CMSP的方式结果是一致的,只是用培育的主动脉滑腻肌细胞制备细胞膜固定相后能够提高固定相上受体的纯度和密度,延长药物在色谱柱上的保留时刻。
已有的研究说明大鼠主动脉的要紧功能α1AR属于α1D亚型,而大鼠肾动脉的要紧功能α1AR属于α1A亚型[1012]。
韩启德教授的课题组采纳RNA酶爱惜分析与定量液相杂交方式显示在大鼠主动脉α1ARmRNA的水平尽管以α1D亚型最高(占57%),但α1A与α1B亚型一样有mRNA的表达[13]。
那个结论与咱们用CMC法得出的实验结果相符:
α1DAR、α1AAR高选择性药物在大鼠主动脉组织色谱柱上均有保留,但亲和力大小不同。
最初以为α2AR仅存在于阻力血管滑腻肌而不存在于大血管,是依照在完整器官灌流条件下能显示突触后α2AR增加灌流压的效应,而在离体血管标本那么测不到α2AR介导的缩血管效应。
随着放射配体结合分析技术的产生与应用,此刻证明除阻力血管外,很多大血管滑腻肌中确实存在功能性α2AR。
本次实验选用α2AR高选择药物育亨宾,通过CMC法也证明了在主动脉血管上存在α2AR。
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