荧光光谱分析法-课件.ppt
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12008年诺贝尔化学奖下村修现年80岁的下村修1928年出生于日本京都府,1960年获得名古屋大学理学博士学位后赴美,先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。
他1962年从一种水母中发现了荧光蛋白,被誉为生物发光研究第一人。
马丁沙尔菲马丁沙尔菲出生于1947年,现年61岁,是美国哥伦比亚大学生物学教授。
他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用,这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。
瑞典皇家科学院8日宣布,美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家马丁沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得2008年度诺贝尔化学奖,将均分1000万瑞典克朗(约合140万美元)奖金。
帮助他们获奖的是绿色荧光蛋白。
这种蛋白为生物与医学实验带来革命,它发出的荧光像一盏明灯,帮助研究人员照亮生命体在分子层面和细胞层面的诸多反应。
由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就发出鲜艳绿光,研究人员将绿色荧光蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞的遗传信息之中,让其随着这些需要跟踪的细胞复制,可“照亮”不断长大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症对大脑造成的损害、观察有害细菌的生长,或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何产生分泌胰岛素的细胞。
23用荧光抗体染色之用荧光抗体染色之原生动物原生动物澳大利亚科学家最新发现,澳大利亚科学家最新发现,一种叫一种叫“螳螂虾螳螂虾”的海里的海里动物通过发出色彩鲜艳的动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶,者吸引性配偶,4K.Brejcet.al.,PNAS94(1997)23061nmgreen-fluorescentprotein(GFP)5第五章第五章荧光荧光分析法分析法第一节第一节荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理第二节第二节荧光定量分析方法荧光定量分析方法第三节第三节荧光分光光度计荧光分光光度计6某些物质受到光照射,除吸收某种波长的光之外,发射出某些物质受到光照射,除吸收某种波长的光之外,发射出比原来所吸收光的波长更长的光比原来所吸收光的波长更长的光光致发光光致发光(二级光)。
(二级光)。
光致发光光致发光荧光荧光fluorescence磷光磷光phosphorescence荧光分析法是根据物质的荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置荧光谱线的位置及其及其强度强度进进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。
行物质鉴定和含量测定的仪器方法。
7分子荧光分析的特点:
分子荧光分析的特点:
1.灵敏度灵敏度高:
高:
一般紫外一可见分光光度法的检出限一般紫外一可见分光光度法的检出限约为约为10-7g/ml,而荧光分析法的检出限可达到而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至甚至10-12g/ml。
2.选择性选择性好好3.线性范围线性范围宽宽4.应用范围应用范围窄窄8第一节第一节荧光荧光分析法的基本原理分析法的基本原理1.分子荧光的产生分子荧光的产生一、分子荧光一、分子荧光molecularfluorescence分子能级比原子能级复杂分子能级比原子能级复杂在在分子体系中,分子体系中,每个电子能级上都存在振动、转动能级每个电子能级上都存在振动、转动能级室温下大多数分子处于基态的最低振动能层室温下大多数分子处于基态的最低振动能层在基态时,含有偶数个电子的分子,电子的在基态时,含有偶数个电子的分子,电子的ms为为+1/2和和-1/2,s=0,M=1。
则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为基态单重态基态单重态,用符号用符号S0表示表示9分子吸收辐射后分子吸收辐射后电子被激发且不发生自旋方向的改变电子被激发且不发生自旋方向的改变ms为为+1/2和和-1/2,s=0,M=1。
则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为激发单重态激发单重态,用符号用符号S表示。
表示。
(S1S2S3)电子被激发且伴随着自旋方向的改变电子被激发且伴随着自旋方向的改变ms为为+1/2和和+1/2,s=1,M=3。
则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为激发三重态激发三重态,用符号用符号T表示。
(表示。
(T1T2T3)S010小结:
分子能级与跃迁小结:
分子能级与跃迁基基态态(S0)激激发发态态:
吸吸收收特特定定频频率率的的辐辐射射;量量子子化化;跃跃迁迁一次到位;一次到位;激激发发态态基基态态:
多多种种途途径径和和方方式式(见见能能级级图图);速速度度最最快快、激发态寿命最短的途径占优势,发生的几率大;激发态寿命最短的途径占优势,发生的几率大;第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态S1、S2;第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态T1、T2;电子能级的多重性电子能级的多重性M=2S+1平平行行自自旋旋比比成成对对自自旋旋稳稳定定(洪洪特特规规则则),三三重重态态能能级级比比相相应应单重态能级低;单重态能级低;大多数有机分子的基态处于单重态;大多数有机分子的基态处于单重态;11S0S1、S2允许跃迁;允许跃迁;S0T1、T2禁阻跃迁;通过其他途径进入禁阻跃迁;通过其他途径进入(见能级图见能级图);进入的几率小;进入的几率小;小结:
激发单重态与激发三重态的不同小结:
激发单重态与激发三重态的不同激激发发单单重重态态分分子子中中没没有有净净电电子子自自旋旋,因因而而具具有有反反磁磁性性;激激发三重态有发三重态有2个自旋平行电子,是顺磁性的个自旋平行电子,是顺磁性的激激发发单单重重态态分分子子平平均均寿寿命命短短(10-810-6s),而而激激发发三三重重态态的长(的长(10-410s)基基态态单单重重态态到到激激发发单单重重态态的的激激发发,不不涉涉及及电电子子自自旋旋方方向向的的改改变变而而容容易易发发生生,属属于于允允许许跃跃迁迁;而而到到激激发发三三重重态态属属于于禁禁阻阻跃迁跃迁12S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量214外转换33T2内转换振动弛豫13激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态,返返回回基基态态时时,通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量;和无辐射跃迁等方式失去能量;荧光延迟荧光磷光辐射跃迁辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁传递途径传递途径内转移外转移系间跨越振动弛豫荧光荧光:
10-710-9s,第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态磷光磷光:
10-410s;第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态14辐射和辐射和非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程振动弛豫振动弛豫:
同一同一电子能级中,以电子能级中,以热能量交换形式由高振动能热能量交换形式由高振动能层至低相邻振动能层间的跃迁层至低相邻振动能层间的跃迁。
发生振动弛豫的时间。
发生振动弛豫的时间1010-12-12ss内转换:
内转换:
相同多重态的电子能级间的相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁等能级的无辐射跃迁。
通过内转换和振动弛豫,高激发单重态的电子跃回第一激通过内转换和振动弛豫,高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。
发生内转换的时间发单重态的最低振动能级。
发生内转换的时间10-13s。
荧光发射:
荧光发射:
电子由电子由第一激发单重态的最低振动能层第一激发单重态的最低振动能层基态基态(荧光多为荧光多为S1S0跃迁跃迁),发射波长为发射波长为3的荧光,的荧光,10-710-9s。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小,波长长:
发射荧光的能量比分子吸收的能量小,波长长:
321;15系间跨越:
系间跨越:
激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的生变化的非辐射跃迁非辐射跃迁。
禁阻跃迁,但当能层有较大重叠时禁阻跃迁,但当能层有较大重叠时S1T1就可发生系间就可发生系间跨越,通过自旋跨越,通过自旋轨道耦合进行。
轨道耦合进行。
10-6s外转换:
外转换:
激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的转移能量的非辐射跃迁非辐射跃迁。
常发生在。
常发生在S1或或T1S0外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。
磷光发射:
磷光发射:
电子电子由第一激发三重态的最低振动能级由第一激发三重态的最低振动能级基态基态(T1S0跃迁跃迁);发光速度很发光速度很慢慢:
10-4100s、磷光的磷光的能量比荧光小能量比荧光小电子由电子由S0进入进入T1的过程:
(的过程:
(S0T1禁阻跃迁)禁阻跃迁)S0激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫T1光照停止后,可持续一段时间光照停止后,可持续一段时间162.荧光的激发光谱与荧光光谱荧光的激发光谱与荧光光谱excitationspectrumandfluorescencespectrum(11)荧光的激发光谱荧光的激发光谱激发光谱:
激发光谱:
表示表示不同激发波长不同激发波长下所引起物质下所引起物质发射某一波长荧光发射某一波长荧光的的相对效率。
相对效率。
绘制激发光谱:
绘制激发光谱:
固定固定发射发射波长波长(选选最最大大发发射射波波长长),),然然后后以以不不同同波波长长的的入入射射光光激激发发荧荧光光物物质质,以以荧荧光光强强度度F对对激发波长激发波长作图作图,即为激发光谱。
,即为激发光谱。
荧光分子都具有两个特征光谱:
荧光分子都具有两个特征光谱:
激发光谱激发光谱和和发射光谱(荧光光发射光谱(荧光光谱)谱)。
17激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分子最多,荧光强激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分子最多,荧光强度最大,称为度最大,称为最大激发波长最大激发波长ex
(2)荧光的发射光谱(荧光光谱)荧光的发射光谱(荧光光谱)荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。
绘制发射光谱时,度。
绘制发射光谱时,使激发光波长使激发光波长固定在固定在ex处处,然后对发,然后对发射光谱扫描,测定各种波长下相应的荧光强度,射光谱扫描,测定各种波长下相应的荧光强度,以以荧光强度荧光强度F对发射波长对发射波长作图作图,得发射光谱图(即荧光光谱)。
,得发射光谱图(即荧光光谱)。
发射光谱(荧光光谱)的位置?
发射光谱(荧光光谱)的位置?
磷光光谱的位置?
磷光光谱的位置?
1819激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移位移荧荧光光光光谱谱总总是是位位于于物物质质激激发发光光谱谱的的长长波波一一侧侧,即即荧荧光光波波长大于激发光波长的现象。
长大于激发光波长的现象。
激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值:
振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。
振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。
b.荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关电子可以跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量电子可以跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量(如能级图如能级图2、1),产生不同吸收带,但荧光光谱却只有一,产生不同吸收带,但荧光光谱却只有一个发射态,如个发射态,如3。
为什么?
为什么?
20cc.镜像规则镜像规则由于电子基态的振动能级分布与激发态相似,由于电子基态的振动能级分布与激发态相似,故通常故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长各小峰波长递减值与递减值与振振动能级差动能级差有有关,各小峰关,各小峰的高度与的高度与跃跃迁几率迁几率有关。
有关。
21基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动动能级分布类似能级分布类似;基基态态上上的的某某振振动动能能级级若若跃跃迁迁到到第第一一激激发发态态的的某某振振动动能能级的几率较大的话,级的几率较大的话,相反跃迁也如此相反跃迁也如此。
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