微机模拟蛋白质纯化实验.docx

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微机模拟蛋白质纯化实验

微机模拟蛋白质纯化实验

学号：

1035130150

：

睿

班级：

生命科学学院10级生物工程

：

1059508633qq.

一、实验目的：

1.了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。

2.进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。

二、实验原理：

1：

“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。

任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费（根据提取步骤计算得到）不得超过一个特定值。

在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度围和pH稳定围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。

2：

“Protein”提供的分离纯化方法有七种：

①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析（凝胶色谱）；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。

3：

在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。

层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。

在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。

排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。

4：

“Protein”提供了四种电泳方法：

即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。

这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。

三、实验要求：

完成实验软件中三种酶的分离纯化。

四、实验步骤：

实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品：

1.pH稳定围较大的1号蛋白

2.碱性条件下稳定的36号蛋白

3.酸性条件下稳定的3号蛋白

1：

酸性条件下稳定的3号蛋白

3号酶在62℃以下稳定，稳定pH围3.8～5.8（酸性条件）。

以上为总步骤

二维电泳，pH3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

以上为第一步骤具体参数

以上为第二步骤具体参数

以上为第三步骤集体参数

以上为第三步洗脱曲线

以上为第三步之后的二维电泳，pH3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

以上为第四步的具体参数

以上为第四步的洗脱曲线

以上为第四步之后的二维电泳，pH3～10，分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

已经达到一个点的要求

PAGE：

分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：

磷酸二氢钾-NaOH，pH8.0

已经达到一个点要求

SDS-PAGE：

分离胶浓度20％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）。

已经达到一条线要求

由以上试验可得酶活力回收91.86％，纯化倍数为20.577，耗费986.8054元，费时35小时。

2：

碱性条件下稳定的36号蛋白

36号酶在31度下稳定，稳定pH围7.7-10

以上为总步骤

二维电泳，pH3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

第一步的具体参数

第一步的洗脱曲线

第一步之后的二维电泳，pH3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

第二步的具体参数

第二步的洗脱曲线

二维电泳，pH3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

已经达到一个点

PAGE缓冲体系：

Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6。

可以看出，已经基本达到一个点。

SDS-PAGE：

分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）

已经达到只有一条清晰的线

由以上试验可得酶活力回收93.01％，纯化倍数为15.605，耗费340元，费时20小时。

3：

pH稳定围较大的1号蛋白

1号酶在50度下稳定，稳定围2-11（稳定围较大）

以上为总步骤

二维电泳，pH3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

以上为第一步的具体参数

以上为第二步的具体参数

以上为第二步骤的洗脱曲线

以上为第二步后二维电泳，pH3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

以上为第三步的具体参数

以上为第三步的洗脱曲线

二维电泳，pH3～10，分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）

已经达到一个点

PAGE：

分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数），缓冲体系：

磷酸二氢钾-NaOH，pH8.0

已经达到一个点要求

SDS-PAGE：

分离胶浓度10％（体积分数），浓缩胶浓度3％（体积分数）。

已经达到一条线要求

由以上试验可得酶活力回收95.07％，纯化倍数为5.746，耗费752.7元，费时25小时。