AIHA患者外周血Th1Th2Tc1Tc2亚群的研究及意义.docx

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AIHA患者外周血Th1Th2Tc1Tc2亚群的研究及意义

AIHA患者外周血Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群的研究及意义

　　作者：

吴伟全，孙炎华，邱少玲

【关键词】自身免疫性溶血性贫血

　　［摘要］目的：

研究自身免疫性溶血性贫血（autoimmunehaemolyticanaemia，AIHA）患者外周血Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群极化状态，分析AIHA的免疫学发病机制，为AIHA的临床治疗提供新的理论依据。

方法：

收集AIHA患者及健康对照组外周抗凝静脉血，分离纯化T细胞。

以Cy5标记的抗CD4、CD8单抗和PE标记的CD30单抗作双色流式细胞术，分析AIHA患者Th／Tc、Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群的比例变化。

结果：

与正常对照组相比，AIHA患者外周血CD4+细胞百分率显着降低（P0．05），CD8+细胞百分率无明显变化（P0．05），CD4+/CD8+比例明显降低（P0．05），CD4+CD30-T、CD4+CD30+T细胞百分率明显下降，CD4+CD30-T／CD4+CD30+T和CD8+CD30-T／CD8+CD30+T比例均明显升高（P0．05），而CD8+CD30-T及CD8+CD30+T细胞百分率无明显变化（P0．05）。

结论：

AIHA患者外周血存在细胞免疫功能失调，T细胞亚群极化状态发生改变，呈明显Th1／Tc1型细胞优势；Th1／Tc1型细胞介导的细胞免疫可能与AIHA的免疫学发病机制有关。

　　［关键词］自身免疫性溶血性贫血；T细胞亚群；研究

　　StudyonTh1／Th2、Tc1／Tc2SubsetsonPeripheralBloodofthePatientswithAutoimmuneHaemolylicAnaemiaandIt‘sSignificance

　　Abstract:

ObjectiveToinvestigatethechangeofTh1likeandTh2likecellsbalanceinautoimmunehaemolyticanaemia（AIHA）patients．MethodsTheratiosofTh／Tc，Th1／Th2andTc1／Tc2inperipheralbloodTcellswereanalyzedbyimmunofiuorescencestainingandbicolorflowcytometry（FCM）invitro．ResultsComparedwiththeratiosofTh1／Th2（48．76％±6．17％）andTc1／Tc2（18．90％±4．12％）inhealthypeople，theratiosofTh1/Th2（56．21％±5．95％）andTc1／Tc2（23．09％±3．31％）inAIHApatientsincreasedobviously．FCManalysisshowedthataveragepercentagesofTh，Th1，Th2，Tc，Tc1andTc2are（22．31％±6．51％），（21．92％±6．42％），（0．37％±0．14％），（32．12％±6．15％）,（30．95％±5．45％）and（1．34％±0．84％）inAIHApatientsversus（38．24％±5．82％），（38．01％±5．47％），（0．90％±0．16％），（31．25％±5．63％），（29．72％±5．20％）and（1．52％±0．68％）inhealthypeople．TheaveragepercentagesofTh,Th1andTh2decreasedobviously．WhiletheaveragepercentagesofTc,Tc1andTc2didnotchanged．ConclusionTheratiosofTh1／Th2andTc1／Tc2inperipheralbloodTcellswereincreasedobviouslyinAIHApatients．ItsuggestedthatcellularimmunityinAIHApatientsisshiftedtoTh1typeimmunity，whichmayrelatetothemechanismofAIHA．

　　Keywords：

Autoimmunehaemolyticanaemia；Tcellsubsets;Study

自身免疫性溶血性贫血（autoimmunehaemolyticanaemia，AIHA）是一种器官特异性的自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明了。

研究发现AIHA的发生发展与患者体内T细胞的极化状态有关。

目前研究认为CD30可能是Th2、Tc2特异性表面标志物之一，本研究应用PE标记的抗CD30单抗和Cy5标记的CD4、CD8作双色流式细胞术，检测AIHA患者及健康人群外周血T细胞各亚群的百分率。

分别以CD4+CD30-T、CD4+CD30+T、CD8+CD30-T及CD8+CD30-T细胞代表Th1、Th2、Tc1及Tc2细胞，并进一步探讨Th1类／Th2类细胞极化漂移在AIHA发病机制中的作用。

　　1材料与方法

　　1．1研究对象35例AIHA患者取自本院及广东医学院附属医院血液科，男15例，女20例，年龄3岁~69岁，中位年龄45岁，均符合AIHA诊断标准，并于用药前取外周抗凝血；正常对照35例为健康人群，排除AIHA及其他自身免疫性疾病，其中男16例，女19例，年龄5岁~57岁，中位年龄37岁。

　　1．2主要试剂和仪器AntiCD4Cy5、AntiCD8Cy5（EB公司）、AntiCD30-PE、MslgG1Cy5、MslgG1PE（Miltenyibiotec公司）、小牛血清、溶血素（0．85％NH4Cl溶液）、hCD3+TcellEnrichmentColumn、淋巴细胞分离液（AXISSHIELD公司）、EPICSXL型流式细胞仪（Beckman公司）。

　　1．3研究方法

　　1．3．1外周血T细胞的分离无菌采集患者及正常人外周静脉血4ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞。

无菌玻璃培养皿37℃培养30min，去除黏附于玻璃培养皿的单核细胞，以获取悬浮的淋巴细胞。

加入0．85％NH4Cl溶液溶解红细胞，经T细胞分离富聚柱（hCD3+TCellEnrichmentColumn）采用负筛选法获得纯化的T淋巴细胞。

用20％的小牛血清RPMI1640培养液调整细胞浓度约2×106/ml。

FCM法检测其纯度大于98％，台盼蓝拒染法检测其活性大于97％。

　　1．3．2Th、Tc、Th1、Th2、Tc1、Tc2亚群的测定取3支试管，各加入100μlT细胞悬液，3管分别加入小鼠抗人单克隆IgG1PE和小鼠抗人单克隆IgG1Cy5（阴性对照管）、抗CD4Cy5和CD30-PE（CD4+管）、抗CD8-Cy5和抗CD30PE（CD8+管），各种标记抗体均15μl，混匀，4℃避光30min，PBS洗涤2次，各管加入0．5ml缓冲液，上流式细胞仪检测。

　　1．4统计分析所有结果以±s表示，两两比较采用成组t检验，经SAS8．22软件分析，取P0．05有统计学意义。

　　2结果

　　2．1Th、Tc、Th／Tc细胞的检测结果AIHA患者外周血Th细胞百分率及Th／Tc比例明显下降，与正常人群比较差别有统计学意义（P0．05）；Tc细胞百分率无明显变化，与正常人群比较差别无统计学意义（P0．05）（见表1）。

　　表1AIHA患者及正常人外周血Th、Tc细胞的检测（略）

　　注：

与正常对照组比较，*P0．05；**P0．05

　　2．2Th1、Th2、Tc1、Tc2、Th1／Th2、Tc1／Tc2的检测结果AIHA患者外周血Th1、Th2细胞百分率明显下降，与正常人群比较差别有统计学意义（P0．05）：

Tcl、Tc2细胞百分率无明显变化，与正常人比较差别无统计学意义（P0．05）；Th1／Th2及Tc1／Tc2比例升高，与正常人比较差别有统计学意义（P0．05），见表2。

　　表2AIHA患者及正常人群外周血Th1/Th2、Tc1／Tc2细胞的检测（略）

　　注：

与正常对照组比较，*P0．05；**

　　3讨论

　　自身免疫病是临床上常见的一类疾病，然而引起自身免疫病的原因和机制十分复杂，目前尚未完全明了。

可能与自身抗原的出现、免疫调节异常、Fas／FasL表达异常等多种因素有关，根本原因可能是自身成分具有免疫原性和／或自身免疫耐受的破坏，发生持久和过度的自身免疫应答。

　　目前研究资料表明，Th／Ts（CD4+／CD8+）细胞的平衡在自身免疫病的发生发展过程中起重要作用。

CD4是T辅助／诱导细胞（Th／Ti）的表面标志，CD4+T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能。

起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。

CD8是抑制／杀伤T细胞（Ts／Tc）的表面标志，CD8+T细胞具有细胞毒效应及抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用。

Th／Ts（CD4+/CD8+）比例变化反映了机体的免疫功能状况，比例升高表明免疫功能亢进，比例降低表明免疫功能低下。

本研究发现，AIHA患者CD4T百分率及CD4+／CD8+比例均明显降低，CD8+T百分率无明显变化。

结果提示，AIHA患者Th／Ti数量及比例降低，反应了AIHA患者体内存在细胞免疫调节异常，AIHA患者可能存在T细胞免疫功能低下，但是自身反应性T细胞可能是异常活化的。

　　人类CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子不同至少可分为Th0、Th1、Th2三个亚群。

其中Th1亚群可分泌IL2、IFNγ等细胞因子，促进细胞免疫，激活细胞毒T细胞，巨噬细胞，吞噬杀伤靶细胞，也可分泌TNFα、β等细胞因子作用于靶细胞；Th2亚群主要分泌IL4、IL5、IL10等细胞因子而促进体液免疫反应。

近年来研究发现，人类CD8+T细胞至少可分为Tcl、Tc2两个亚群。

Tc1与Th1相似，可分泌IL2、IFNγ等细胞因子：

Tc2与Th2相似，可分泌IL4、IL5、IL10等细胞因了［3］。

Mosmann等［4］将Th1／Tc1、Th2／Tc2细胞分别称为Th1类、Th2类细胞。

Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生发展密切相关，Alves等认为Th1／Th2细胞间的平衡，是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽。

因此，建立一种准确、灵敏、快速的检测Th的方法十分必要。

目前检测Th1／Th2的方法有多种，其基本原理都是外周血淋巴细胞经刺激后，检测培养液中细胞因子的含量，或者检测细胞内细胞因子的表达。

但是它们都无法判断所分泌的细胞因子是来自CD4+T细胞或是其他单个核细胞，所以并不能真正地检测出Th细胞的极化状态。

　　Thl类／Th2类细胞间的平衡状态对研究包括AIHA在内多种自身免疫病有重要意义，然而，长期以来，一直缺乏一种特异性表面标志以区别Th1类／Th2类细胞。

近年来有研究发现CD30是检测Th2和Tc2细胞可靠的表面标志，DelPrete等［1］研究发现Th1细胞克隆基本上不表达CD30mRNA，其CD30膜结合形式及可溶性形式水平也检测不到，而在Th2细胞克隆，CD30mRNA及CD30膜蛋白结合形式则大量表达，并释放出大量的sCD30。

Chilosi等［5］从一名类Omenm综合征（OLS）患者外周血中分离出的CD30+T细胞形成的集落中，绝大多数具有Th2细胞特征，而CD30T细胞集落多数是Th1细胞。

Nakamura等［6］研究发现，IL4能施用诱导CD30在活化的CD4+T细胞上表达，在内源性IL4缺失的状态下，Th2细胞会失去CD30表达的能力。

目前国外相关研究均表明CD30是Th2细胞的标志之一。

本研了以PE标记的抗CD30单抗测得的正常人外周血T细胞中CD4+CD30+T（Th2）细胞为（0．80±0．16）％，与Nagata等［7］的结果相似。

因此我们可以运用CD30或sCD30的表达水平来分析Th2细胞在一些疾病发病机制中的作用，可为疾病的活动性、预后评估等方面提供一定的帮助，但其价值还有待进一步研究。

　　AIHA是一种常见的自身免疫性疾病，临床上以溶血性贫血为主要特征。

主要是由于服用药物或病毒感染后，使红细胞膜表面成分发生改变，从而刺激机体产生抗红细胞的自身抗体，这种抗体与自身改变的红细胞结合导致红细胞破坏增加所致。

然而，越来越多的资料显示，除体液免疫机制外，细胞免疫起着非常重要的作用。

本研究应用流式细胞术检测纯化的外周血T细胞，分别以CD4+T细胞，CD8+T细胞代表Th、Tc细胞，以CD30区分Th1类和Th2类细胞。

我们的结果发现AIHA患者外周血Th1类／Th2类细胞间失衡，呈现明显Th1类优势，这一结论与Fagiolo等［8，9］的报道一致。

同时，我们发现，尽管AIHA患者Th细胞下降，Tc细胞无明显变化，然而Th1／Th2及Tc1／Tc2比例均明显升高，提示在AIHA的发病过程中，Th1类／Th2类比例较Th和Tc细胞数所起的作用更为明显。

AIHA患者体内Th1类／Th2类比例升高，提示机体自身反应性细胞免疫功能亢进。

在AIHA发生发展过程中，Th1细胞可通过分泌IL2、IFNγ等细胞因子，激活细胞毒T细胞、巨噬细胞，杀伤红细胞；而活化的Tc1细胞，也就是通常所说的Tc细胞，则能通过分泌穿孔素、颗粒酶特异性地杀伤红细胞［10，11］。

　　本研究表明，通过对Th1类/Th2类细胞平衡在AIHA中的作用的研究，不仅有助于阐明AIHA的发病机制，而且有可能为我们提供治疗AIHA的新方法，即通过调节Thl类/Th2类细胞的动态平衡，来调节过强的体液免疫或细胞免疫，达到治疗自身免疫病的目的［12］。

　　参考文献：

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　　［3］WoodlandDL，Dutton　ofCD4（+）andCD8（+）Tcells［Ｊ］．CurrOpinImmunol．2003,15（3）：

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　　［5］EliosMM，RomagnaniP，ScalettiC，etal．InvivoCD30expressionindiseaseswithpredominantactivtionofTh2likeTcell［Ｊ］．JleikocBiol,1997,61（5）：

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　　［7］NagataK，TanakaK，OgawaK，etal．selectiveexpressionofanovelsurfacemoleculebyhumanTh2cellsinvivo［J］．JImmunol,1999,162（3）：

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