衔接蛋白2敲除对AT1受体介导的AngⅡ内吞的阻碍.docx

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衔接蛋白2敲除对AT1受体介导的AngⅡ内吞的阻碍

衔接蛋白2敲除对AT1受体介导的AngⅡ内吞的阻碍

张勇娄冬梅康劲松刘全

【摘要】目的通过RNAi沉默AP2μ2亚单位的表达，观看其是不是阻碍AT1R介导的AngⅡ内吞。

方式通过设计构建的AP2μ2RNAi表达载体，转染H9C2细胞，通过Western印迹验证沉默成效;激光共聚焦显微镜观看沉默AP2μ2基因对AT1R介导的AngⅡ内吞的阻碍。

结果蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2μ2蛋白表达的阻碍，可见pSH1SiAP2plasmid1表达质粒可明显抑制AP2μ2蛋白表达。

给予AngⅡ不同时刻点，可见其在15min时受体内吞至胞内数量最多。

重组质粒沉默AP2μ2亚单位后，外源加入AngⅡ后，可明显抑制AT1R介导的AngⅡ内吞。

结论AT1R介导AngⅡ内吞的发生，与其他GPCR一样，要紧通过网格蛋白依托的内吞方式进行，而且需要AP2蛋白参与。

【关键词】衔接蛋白2;内吞;血管紧张素Ⅱ;AT1R

受体介导的内吞（Receptormediatedendocytosis）是目前公认的生物体摄取细胞外大分子的要紧途径。

最近几年发觉G蛋白偶联受体（GPCRs）的内吞对受体功能调剂亦超级重要。

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和其GPCRs血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）一直被以为介导了心血管疾病和代谢性疾病的终末器官损害〔1〕，二者在细胞膜上结合后通过受体内吞的形式进入细胞内。

最近几年来，人们在探讨肾素血管紧张素系统（RAS）对靶器官和组织病理生理作用的细胞内信号转导机制时，以为AngⅡ与AT1R除在细胞膜上结合激活下游信号转导，二者还可能通过AT1R介导的内吞进入细胞内继续发挥生物学作用。

　　衔接蛋白2（Adaptorprotein2，AP2）是细胞膜表面最要紧的衔接蛋白，由2个大亚基（α和β2），一个中亚基（μ2）和一个小亚基（σ2）组成〔2〕。

有研究报导用siRNA技术抑制AP2μ2亚单位的表达可明显抑制转铁蛋白受体（TransferrinReceptor）的内吞〔3〕。

转铁蛋白受体与AT1R同为GPCRs，提示AP2是不是也参与了AT1R介导的AngⅡ内吞的进程。

因此，本实验通过RNAi技术沉默AP2μ2亚单位的表达，观看是不是阻碍AT1R介导的AngⅡ内吞，为进一步研究AngⅡ与AT1R在细胞内的信号转导作用提供理论依据。

　　1材料与方式

　　材料和试剂AngⅡ抗体由日本大阪医科大学药理教研室的金德男教授惠赠;βactin和荧光二抗等抗体购自美国SANTACRUZ公司;AP2μ2抗体（AP50）购自美国BD公司。

溴化乙锭、SDS、TEMED、丙烯酰胺、N，N-二甲基双丙烯酰胺、PMSF购自美国Sigma公司;DAB、TritonX100、Tween20购自北京鼎国生物技术;胰酶、DMEM培育基为美国Hyclone公司产品;小牛血清购自美国Gibco公司;蛋白酶抑制剂购自大连宝生物工程公司;其他常规化学试剂均为分析纯产品。

大鼠心肌细胞株H9C2购自中国科学院细胞库。

　　方式

　　蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2μ2蛋白表达的阻碍在前期实验中，本实验室已经成功构建了3条AP2μ2基因siRNA表达载体（pSH1SiAP2）（论文待发表），经测序未见错配和丢失碱基。

在6孔板中完成pSH1SiAP2表达质粒向H9C2细胞的转染，提取细胞总蛋白，Western印迹检测AP2μ2蛋白表达。

将细胞分为正常对照组、阴性对照组、AP2plasmid1组、AP2plasmid2组、AP2plasmid3组共5组。

以βactin表达水平作为等量蛋白质上样对照，取60μg蛋白质样品进行SDSPAGE电泳，转至硝酸纤维素膜上;室温封锁2h后，用含%Tween20的TBS缓冲液（TBST）漂洗3次，每次10min;加入相应的AP2μ2抗体（1∶200），4℃孵育留宿，TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000），37℃摇床温育2h，最后经DAB显色，凝胶图像分析系统分析蛋白的表达。

　　给予AngⅡ不同时刻点观看其在H9C2细胞内的内吞转变进程将适合尺寸的盖玻片高压灭菌，放入24孔板内，种入适宜的细胞浓度。

待细胞融合度达到60%～70%时，，加入AngⅡ10-7mol/L，别离于五、1五、30和60min终止药物作用，4%多聚甲醛固定30min。

1%TritonX100作用10min;PBS洗3次，5min/次;3%H2O2室温10min，PBS洗3次，5min/次;非免疫动物血清，室温15～20min，倾去多余液体，不洗，滴加特异性一抗，室温半小时，然后4℃留宿。

PBS洗3次，5min/次。

滴加荧光二抗，避光室温10～15min，PBS洗3次，5min/次。

甘油封片剂封片固定，在激光共聚焦显微镜下观看并照片。

　　观看siRNA重组质粒沉默AP2μ2亚单位对AT1受体介导的AngⅡ内吞的阻碍将适合尺寸的盖玻片高压灭菌，放入24孔板内，种入适宜的细胞浓度。

待细胞的融合度达到60%～70%时，正常对照组不做任何处置，阴性对照组只加入AngⅡ10-7mol/L作用15min，转染pSH1SiAP2plasmid1质粒24h。

加入AngⅡ10-7mol/L，15min，其中AP2plasmid1组细胞在加AngⅡ前30min，加苯砷氧化物（PAO），μmol/L，而不转染质粒。

AP2plasmid2组细胞4%多聚甲醛固定30min。

其余方式同，最后在激光共聚焦显微镜下观看并照片。

　　统计学方式数据均采纳x±s表示，采纳统计软件包处置，两两比较采纳t查验。

　　2结果

　　蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2μ2表达的阻碍用H9C2细胞及转染pSH1SiAP二、pSH1SiScramble表达质粒的细胞提取总蛋白，通过western印迹法检测细胞中AP2μ2蛋白表达情形。

其中转染了pSH1SiAP2plasmid1的H9C2细胞AP2μ2蛋白的表达明显降低（P<，说明pSH1SiAP2expressionplasmid1可明显沉默AP2μ2蛋白表达，后续共聚焦观看内吞实验均用此表达质粒转染（图1）。

　　外源给予H9C2细胞AngⅡ不同时刻点其内吞转变正常H9C2细胞，外源性加入AngⅡ10-7mol/L，作用不同时刻点（五、1五、30和60min），激光共聚焦显微镜结果显示：

5min可见H9C2细胞内可见绿色点状荧光显现，15min时，点状荧光强度最强，持续至60min时，细胞内的荧光强度达最弱。

提示AT1R介导的AngⅡ内吞作用在5min时就开始发生，15min时受体内吞至胞内的数量达到最多。

因尔后续实验选择外源给予AngⅡ10-7mol/L，作用15min，来观看细胞内吞情形（图2）。

　　沉默AP2μ2对H9C2细胞AT1受体介导的AngⅡ内吞的阻碍正常对照H9C2细胞胞浆内未见明显点状荧光;未转染质粒的细胞，外源给予AngⅡ10-7mol/L，15min后，胞浆内可见点状绿色荧光;未转染细胞加入μmol/LPAO，30min后再加入AngⅡ10-7mol/L，15min后未见胞浆内有点状绿色荧光;细胞转染质粒pSH1SiAP2plasmid1，转染后24h加入AngⅡ，15min后细胞内未见点状绿色荧光，即内吞的AngⅡ（图3）。

　　3讨论

　　目前以为RAS与许多心血管疾病联系紧密，AngⅡ作为RAS的要紧效应因子，除可调剂血管张力和钠盐代谢外，还能够阻碍心肌细胞的肥大增生，引发心脏收缩功能减弱。

抑制增强的AngⅡ活性，已经被公以为是延缓心血管疾病最要紧的医治策略〔1〕。

应用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和AT1R阻滞剂（ARB）类药物医治急性心肌梗身后心室重构、改善心功能、降低心力衰竭发生率尽管已取得一些共识，可是ARB对患者心肌重构的远期疗效还存在争议。

　　已知GPCRs的内吞方式要紧分为网格蛋白依托（Clathrindependent）的内吞和非网格蛋白依托（Nonclathrindependent）的内吞两种方式，且受体与配体内吞方式与细胞类型有关〔4〕。

受体与配体复合物在内陷小窝（Coatedpits）处浓缩，在AP和其他蛋白质的参与下，网格蛋白聚集装配多聚化成网状，将胞膜拉向胞质侧，形成包被小泡（Coatedvesicle）。

通过衔接蛋白复合体，网格蛋白连接到胞膜表面，同时AP也参与网格蛋白包被（clathrincoat）的组成〔5〕。

　　AP2是专门参与胞质膜向内体（Endosomes）转化的衔接蛋白〔6〕，目前以为AP2通过识别受体胞内域含酪氨酸的内化基序YXXΦ（其中Y为酪氨酸，X为任一种氨基酸，Φ为大分子疏水氨基酸），调控受体与配体的内吞进程。

其中μ2亚单位能够与生长因子受体的酪氨酸富含区域结合，增进受体与网格包被的联系〔7〕。

突变μ2亚单位，阻碍其对受体的结合，能够抑制受体内吞的发生〔3〕。

因此本实验通过RNAi技术沉默AP2μ2亚单位表达，来探讨AT1R内吞是不是也需要AP2的参与，进一步探讨AT1R介导AngⅡ内吞的细胞机制。

　　本研究前期实验设计了3个AP2μ2亚单位基因RNA干与靶位点，并成功构建了RNAi表达载体，经测序没有错配和丢失碱基。

将3个RNAi表达载体别离转染H9C2细胞，通过蛋白表达检测，pSH1SiAP2plasmid1质粒可明显抑制AP2μ2蛋白表达，因此决定应用第一条重组质粒，观看AP2μ2表达抑制对AT1R内吞的阻碍。

另外，外源给予H9C2细胞AngⅡ10-7mol/L，作用于不同的时刻点（五、1五、30和60min），发此刻5min时，就已经有AngⅡ内吞的发生，一直持续至60min，可是在15min时，细胞内点状绿色荧光强度最强，说明15min时AngⅡ的内吞入胞内的数量最多。

因尔后续实验选择在15min时观看受体介导内吞的改变。

　　通过激光共聚焦显微镜能够观看到，外源加入AngⅡ后，在单纯加药组细胞，AngⅡ与细胞表面AT1R结合后，能够看到明显的内吞进程发生。

而在AP2μ2干与组，细胞内未见绿色荧光颗粒，即内吞的AngⅡ进入细胞内，因此能够判定，AP2μ2亚单位被抑制后，也抑制了AT1R介导的AngⅡ内吞的发生。

同时应用PAO组细胞作为阳性对照，未发觉有AT1R介导的AngⅡ内吞。

因为PAO能够抑制G蛋白偶联受体胞内段酪氨酸激酶活性，进而抑制GPCR内吞的发生〔8〕。

　　通过上述结果分析，AT1R内吞的发生，与其他GPCRs内吞一样，如转铁蛋白受体，要紧通过网格蛋白依托的内吞方式进行，且需要AP2蛋白的参与，并与其他蛋白形成网格蛋白包被，连接到胞膜表面，一起参与了胞膜表面GPCRs的内吞进程。

通过这一机制的研究，进一步探讨了AT1R内吞机制和RAS在心血管疾病发病进程中的作用，为探讨RAS对靶器官和组织损伤的病理进程提供理论基础。

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