waters液质联用.docx
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waters液质联用.docx
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waters液质联用
1.适用围本设备配备ACQUITYUPLC液相色谱仪、XevoTQ-SmicroMS/MS质谱仪,适用于食品、药品中各种有机物的定性、定量分析,是一种具有高灵敏度的检测仪器,仪器由主机、计算机和数据处理软件等组成。
2.职责
2.1操作人员按照本规程操作仪器,认真填写实验使用记录。
2.2保管人员负责对仪器进展定期维护和保养。
2.3科室负责人负责监视检查规程的执行。
3.操作程序
日常操作步骤:
准备UPLC—→设置样品表—→运行样品—→定量—→打印报告。
注:
如果一个星期不运行样品请不要关质谱仪,使其保持真空。
建立新方法和project的操作步骤:
准备UPLC—→建立新的project—→用标准品调谐—→编辑质谱方法—→编辑UPLC方法—→设置样品表—→运行样品—→定量—→打印报告。
3.1开机:
3.1.1彻底开机顺序〔仪器已关闭〕确定MS及其它仪器电源电缆已连接,开氮气发生器、开氩气,小表<0.1mpa。
翻开计算机电源>等待windows正常启动>电脑界面右下角网络图标红叉。
翻开UPLC自动进样器电源,等到电脑界面右下角网络图标出现感慨号!
。
翻开UPLC泵电源,等约30s或者是有响声。
翻开质谱电源,等待5min,离子源透视镜里面亮。
翻开Masslynx软件,masslynx主界面-----左侧instrument----Masstune---界面菜单栏vacuum---pump同样界面左侧偏上diagnostics---vacuum---analyserMS1turbospeed[%]要在5分钟升到80。
至少抽真空4个小时>查看真空状态主界面massconsole---界面左侧xevotqmsdetector加号展开---msdisplay>碰撞室真空度>到达1.32E-5mBar。
3.1.2日常开机顺序〔仪器未关闭〕开氮气发生器、开氩气,小表<0.1mpa,翻开Masslynx软件,进入工作站。
3.2建立工程点击file下的projectwizard,出现对话框,单击yes出现对话框,输入project,location为C:
\MSDATA,单击next,选择createexistingprojectastemplate,并以c:
\masslynx\default.pro为模板,单击finish.点击OK。
3.3准备UPLC系统准备液相的一般流程:
准备流动相>准备样品>灌注二元泵>灌注自动进样器>建立液相方法>平衡液相3.3.1.准备流动相用0.22um的膜过滤缓冲液,所有的缓冲液和超纯水都要新配制,超纯水和缓冲液使用不得超过二天,缓冲盐一定要是可挥发的,而且浓度不要大于10mM。
3.3.2.样品要求所有样品尽量用流动相初始梯度比例的溶剂来溶解,并用0.22um的膜过滤。
3.3.3灌注二元泵在Masslynx主界面,单击MSConsole,进入UPLC交互显示界面,点击左栏AcquityUPLCSystem>Control>StartUpSystem,单击QSM,选择需要用到的流动相位置,如A和B,选择sealwash,时间设为3分钟。
单击SM,选择StrongWash5cycles,Samplesyringe20单击EquilibratetoMethod,将流速设为0,单击Start开场灌注.时间大约为9min左右。
设定流速,平衡液相在Masslynx主界面,单击InletMethod图标,翻开液相方法编辑窗口,单击status>ACQUITYAdditionalStatus,进入液相控制台,单击A或B或流速的位置,出现流速、比例设定对话框,设定液相流速与比例,单击对勾,开场平衡液相,如果后面要做调谐,可设定流速0.2ml/min,有机相与水相的比例为50:
50。
3.4准备质谱
3.4.1.计算化合物单同位素质量数Masslynx主界面>单击Tools>MolecularWeightCalculator,输入化合物的分子式〔大写-注意Cl、Br等正确的输入方法〕,注意选单同位素Monoiso,IonMode:
离子化模式,+ve正离子,-ve负离子,单击Calculate。
3.4.2用Intellistart进展自动调谐在Masslynx主界面单击MSTune图标,翻开调谐窗口,单击IonMode>ES+或ES-,单击APIGas图标翻开氮气,单击翻开高压选择MSMode图标,设定液相流速0.2ml/min,水:
乙腈的比例为50:
50。
把标准品调谐液放入质谱仪塑料瓶位置处的A〔或B〕号位(注:
浓度在200ppb左右)单击Fluidics,选择Reservoir为A,FlowState为LC模式,点击Purge图标。
Purge完毕后,将FlowState改为bine模式,设定Function为MS1scan,Mass为计算出化合物的质量数,span为5,点击进样,开场进样,直到离子的响应比拟稳定。
保存调谐文件:
File>SaveAs至已建的工程下。
在Masslynx主界面,选择MsConsole>XevoTQMSDetector选择Intellistart,选择SampleTuneandDevelopMethod,ES+单击Start图标,出现Intellistart自动调谐编辑窗口,选择SwitchtoAdvancedmode,输入poundname(化合物名称),MolecularMass/Formula(分子量或分子式)AdductA+〔[M+H]+,选择LoadExistingSampleTune,在SampleTuneName方框后的“。
。
。
〞处调用开场保存的调谐文件,在DevelopMRMMethod前的方框打钩,并在方框出输入MRM方法的文件名,路径为已建的工程下。
在PrintReport前方框打钩,ConeVoltage,CollisionEnergy处为默认值,Fluidics下的FlowPath选择bined模式,SampleReservoir和SampleFlowRate参数与Fuldics下bined模式下的进样参数保持一致。
单击右边的Start开场自动调谐。
调谐成功,会有绿勾出现,查看intellistart报告。
3.4.3查看intellistart中自动生成的质谱方法:
从MassLynx主窗口,单击MSMethod,出现MSMethod编辑对话框,选择File>open,选择Intellistart中保存的质谱方法的文件,双击方法,如发现自动调谐生产的质谱方法中局部参数有误,那么可以在Channels窗口手动修改参数,填写relentinonwindow中的end时间,此时间必须与液相色谱方法运行时间保持一致,选择AutoDwell,单击OK,点击File>SaveAs,保存质谱方法文件。
3.5建立液相方法
3.5.1编辑液相方法在液相方法编辑窗口,单击Inlet,输入溶剂名称,runtime及梯度洗脱程序,梯度洗脱程序中最后阶段时间必须与runtime符合,单击OK,选择File>SaveAs保存方法,单击LoadMethod,平衡液相。
3.5.2建立样品列表在Masslynx主窗口,选择File>New建立一个空白的表samplelist。
输入文件名FileName,样品信息FileText,双击MSFile,选择质谱方法,双击InletFile,选择液相方法,在Bottle中输入样品瓶的位置,在InjectVolume中输入进样体积,可右键>Add,增加样品表的行数,保存样品表:
File>SaveAs。
3.6数据采集和处理
3.6.1.选中要采集的样品,单击Run>Start,选择AcquireSampleDataonly,,单击OK开场进样并采集。
3.6.2在采集过程中,可查看色谱图,点击Chromatogram窗口,点击Real-timeUpdateicon.如果不能见整个TIC图,单击DefaultRange图标。
如果方法中包括多个通道,可通过Display>Mass查看如果方法中包括多个检测器或多个Function,可通过Display>TIC查看
3.6.3处理多个Function的数据如果质谱方法中有多个Function,如有三个Function,如想看第二个Function,MSScan的数据。
3.6.3.1在色谱图窗口,点击Display>TIC,选中MSScan,选择Addtrace,单击OK。
3.6.3.2如想查第二个Function,DaughterScan质谱图,在色谱图中,选择Display>TIC,选择ScanWaveDSAddtrace,单击OK。
3.6.3.3.选择Process>binespectra.分别用右键输入信号和本底噪音.单击OK.得到DaughterScan的质谱图,单击Process>Smooth„,单击OK。
3.7数据处理-外标定量法
3.7.1在Masslynx主页面单击Targetlynx/Editmethod,出现定量方法编辑对话框,单击新建方法图标,新建一个定量方法。
3.7.2单击Addnewpound(添加新的化合物)图标,添加一个新的化合物。
3.7.3单击菜单栏update,选中QuantitationIon和poundName〔前面打勾〕在Masslynx主页面,翻开中等偏下低浓度标准品的色谱图,Display/Masschromatogram选出要定量的化合物的离子对,一般强度高的化合物用来做为定量离子,另一个离子对那么作为确证离子,用鼠标右键在定量离子对色谱图上拉一下,那么poundname,AcquisitionFunctionNumber,QuantificationTrace,PredictedRetentionTime和RetentionTimewindow将自动输入到定量方法中。
注意:
在色谱图上拉的时候,要遵循两个原那么,拉的位置要以色谱峰的峰尖左右对称,拉的宽度要超过峰的起点和终点。
3.7.4单击工作曲线图标,在工作曲线设置页面,填入ConcentrationUnits:
浓度单位,例如ng/ml,ug/kg,ppb,ppm等。
ConcentrationofStandard:
Level–选择Conc.A。
PolynomialType–选择Linear.〔可根据自己行业的规定〕CalibrationOrigin_选择exclude(排除原点),include(包含原点),force(强制过原点)WeithtingFunction(权重)_1/x〔根据自己行业规定〕PropagateCalibrationParameters_如果所有的化合物均用一样的工作曲线的参数,选Yes
3.7.5翻开积分参数列表,选中ApexTrackEnabled〔打勾,YES〕,IntegrationWindowExtent输入2,选中PropagateIntegrationParameters(打勾),如果色谱峰并不是很对称的色谱图,可先在色谱图上先设定参数,积分,好积分参数满意之后,process/integrate„/copy,在Targetlynx方法中Edit/Past就可将其粘贴到Targetlynx方法中。
建议用ApexTrack积分方法,Smooth方法建议用smoothiteration1,smoothwidth2。
重复上面的过程,把其他几个化合物的信息全部参加,保存方法:
File/SaveAs,保存到当前工程的MethDB文件夹中,正确的samplelist表格模板,除了前面进样时的选项之外,还要有sampletype,ConA,等选中要处理的样品,单击ProcessSamples,出现下列图的对话框,确保选中,Integrate、sample,calibrateStandard,QuantifySample,选择刚刚编辑的Targetlynx方法,单击OK后,出现定量结果对话框。
可根据自己的需要,用鼠标右键,ChangColumnOrder来增加或减少Summary中的选项。
3.8关机程序
3.8.1日常关机:
3.8.1.1如果流动相中有缓冲盐必须先将缓冲盐换成水,灌注2分钟,流速设为0.2ml/min,80%水相,冲洗至少30分钟,换成80%有机相,冲洗至少20分钟,停流速,水相,冲洗至少30分钟,换成80%有机相,冲洗至少20分钟,停流速,柱温为室温。
3.8.1.2关质谱:
主界面masstune或者电脑下面仪器图标----界面左侧偏上fluidics---flowstate选择为waste、关氩气,masstune界面或者电脑下面仪器图标工具栏第6个>关高压masstune界面右下角>等待去溶剂气温度降低至100度以下masstune界面或者电脑下面仪器图标左侧偏上。
ES+source-----temperature---desolvation>关氮气,点击氮气发生器开启开关。
3.8.2彻底关机
3.8.2.1先完成日常关机
3.8.2.2泄真空:
tunepage>vacuum>vent---yes>等待涡轮分子泵转速降到10以下,masslynx主界面-----左侧instrument----Masstune---界面左侧偏上diagnostics---vacuum---sourceturbospeed[%]
3.8.2.3退出软件,其他界面先退出,主界面最后退出
3.8.2.4关质谱电源>关所有UPLC电源,计算机电源,仪器三个电源顺序无所谓,关氮气发生器,氩气。
3.8.2.5如果有UPS,关闭UPS电源,计算机电源。
4日常维护、保养及考前须知
4.1仪器室要保持整洁、干净、无尘;配套设施布局合理。
4.2仪器室温度应相对稳定,一般应控制在20-25℃,保持恒温;相对湿度最好为50-70%,室应备有温度计和湿度计,一般采用空调和吸湿机调节温度和湿度。
4.3气压过滤机械泵油,停顿样品采集、停顿流动相、关闭高压、关闭所有气流,关闭离子源的真空隔离阀。
用一字镙丝刀顺时针方向拧开机械泵上的GasBallast阀四分之一圈,运行30分钟后再把GasBallast阀旋转到原来关闭的位置。
对于ESI源,至少每星期做一次,对于APCI源,每天做一次。
4.4开高压之前一定要先开氮气,关氮气之前一定要先关高压。
4.5ESI离子化与溶剂密切相关,在使用某些溶剂和添加物需要注意以下几个方面:
三氟乙酸〔TFA〕多用于蛋白质和多肽分析,但对ESI离子化有抑制效应;三乙胺〔TEA〕在m/z102处有较强的[M+H]+峰,有可能会抑制某些碱性化合物在正离子ESI条件下的离子化,也有可能会增强某些碱性化合物在负离子ESI条件下的响应;
4.6要防止使用非挥发性的盐(phosphate,borate,citrate,etc.);外表活性剂、清洁剂和去污剂(会抑制离子化);以及无机酸(sulphuricacid,phosphoricacidetc.)等。
4.7连接UPLC泵、色谱柱、注射泵以及ESI探头时,要将仪器置于standby状态。
4.8.当改变分辨率的时候,仪器的质量数也会有轻微的偏移,所以在不同分辨率的条件下,应该做质量数校正。
4.9样品贮存在塑料离心管中,其中的添加剂很容易混入,尤其是被有机溶剂浸泡时间较长时,会产生干扰物信号。
4.10工作站计算机不要安装与仪器操作无关的软件,要经常清理计算机磁盘碎片,定期查杀病毒,定期备份实验数据。
4.11仪器应定期检查,并有专人管理,负责维护保养及清洁。
4.12实验完毕要清洗进样针、进样阀等,用过含酸的流动相后,色谱柱、离子源都要用甲醇/水冲洗,延长仪器寿命。
4.13定期清洗样品锥孔:
关闭隔断阀,取下样品锥孔,先用甲醇:
水:
甲酸〔45:
45:
10〕的溶液超声清洗10分钟,然后在分别用超纯水和甲醇各溶液超声清洗10分钟,待晾干后再安装到仪器上。
当灵敏度下降时,需要清洗Source、二级锥孔和六级杆。
4.14定期〔每星期〕检查机械泵的油的状态,如果发现浑浊、缺油等状况,或者已经累积运行超过3000小时,要及时更换机械泵油。
5支持性文件WatersXevo-TQ-Smicro液质联用仪使用手册。
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