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色谱法讲义
色谱法讲义
第七章色谱分析基础
一、概述
(一)色谱发展概况
最早创立色谱法的是俄国植物学家Tswett。
他在研究植物叶子的色素成分时,将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。
当时Tswett把这种色带叫做“色谱”(Chromatographie,Tswett于1906年发表在德国植物学杂志上用此名,英译名为Chromatogra-phy),在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”,碳酸钙叫作“固定相”,纯净的石油醚叫作“流动相”。
在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。
直到1931年德国的Kuhn和Lederer才重复了Tswett的某些实验,用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,和γ-胡萝卜素,此后用这种方法分离了60多种这类色素。
Martin和Synge在1940年提出液液分配色谱法(Liquid-LiquidPartitionChromatography),即固定相是吸附在硅胶上的水,流动相是某种有机溶剂。
1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性,11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法(Gas-LiquidChromatography),因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。
在此基础上,1957年Golay开创了开管柱气相色谱法(Open-TubularColumnChromatography),习惯上称为毛细管柱气相色谱法(CapillaryColumnChromatography)。
1956年VanDeemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论,1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论,为色谱的发展奠定了理论基础。
另一方面早在1944年Consden等就发展了纸色谱,1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法(TLC)得以实际应用,而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后,才使TLC得到广泛地应用。
在60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱,出现了高效液相色谱(HPLC)。
80年代初毛细管超临界流体色谱(SFC)得到发展,但在90年代后未得到较广泛的应用。
而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳”(CZE),在90年代得到广泛的发展和应用。
同时集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。
到21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。
1、色谱法在分析化学中的地位和作用
色谱分析法的特点是它具有高超的分离能力,而各种分析对象又大都是混合物,为了分析鉴定它们是由什么物质组成和含量是多少,必须进行分离,所以色谱法成为许多分析方法的先决条件和必需的步骤。
2、色谱法的特点
色谱法是以其高超的分离能力为特点,它的分离效率远远高于其它分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。
(1)分离效率高。
例如毛细管气相色谱柱(柱内径0.1-0.25μm),长30-50m其理论塔板数可以到7万-12万。
而毛细管电泳柱一般都有几十万理论塔板数的柱效,至于凝胶毛细管电泳柱可达上千万理论塔板数的柱效。
(2)应用范围广。
它几乎可用于所有化合物的分离和测定,无论是有机物、无机物、低分子或高分子化合物,甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分离和测定。
(3)分析速度快。
一般在几分钟到几十分钟就可以完成一次复杂样品的分离和分析。
近来的小内径(0.1mm)、薄液膜(0.2μm)、短毛细管柱(1-10m)比原来的方法提高速度5-10倍。
(4)样品用量少。
用极少的样品就可以完成一次分离和测定。
(5)灵敏度高。
例如GC可以分析几纳克的样品,FID可达10-2g/s,ECD达10-3g/s;检测限为10-9g/L和10-12g/L的浓度。
(6)分离和测定一次完成。
可以和多种波谱分析仪器联用。
(7)易于自动化,可在工业流程中使用。
3、色谱法的分类
色谱法或色谱分析(chromatography)也称之为色层法或层析法,是一种物理化学分析方法,它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别,当溶质在两相间做相对移动时,各物质在两相间进行多次分配,从而使各组分得到分离。
可完成这种分离的仪器即色谱仪。
色谱法的分类可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。
(1)、按流动相分
气相色谱gaschromatography(GC)
–流动相是气体,固定相是固体吸收剂或液体(涂在固体上)。
液相色谱liquidchromatography(LC)
–液体作为动流动相。
(2)、按分离机理分类
吸附色谱法
分配色谱法
离子交换色谱法
凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法
亲和色谱法
(3)、按固定相的外形/相系统的形式分类
柱色谱:
填充柱色谱:
固定相装于柱内的色谱法。
毛细管色谱法:
采用内壁涂渍极薄而均匀的固定液膜的毛细管作为色谱柱的气相色谱法。
平板色谱:
固定相呈平板状的色谱法。
(4)、按使用领域不同对色谱仪的分类
实验室用色谱仪
分析用色谱仪
便携式色谱仪
流程色谱仪
实验室用制备色谱仪
制备用色谱仪
工业用大型制备色谱仪
气固色谱:
GC是以气体作为流动相的一种色谱法。
利用不同物质在固体吸附剂上的物理吸附-解吸能力不同实现物质的分离。
应用范围:
只适于较低分子量和低沸点气体组分的分离分析。
GSC
固定相
应用
多孔固体
O2,N2,CO2等稳定气体,低沸点化合物
气液色谱:
它是利用待测物在气体流动相和固定在惰性固体表面的液体固定相之间的分配原理实现分离。
GLC
固定相
应用
惰性载体涂渍高沸点固定液
广泛
二、色谱流出曲线及有关术语
(一)、色谱流出曲线(TheChromatogram)
1、色谱流出曲线(TheChromatogram)/色谱图(TheChromatogram)
在柱子的出口处,由检测器检测到的物质的浓度随时间变化的曲线。
或由检测器输出的电信号强度对时间作图,所得曲线称为色谱流出曲线。
2、色谱峰(chromatographicpeak)
色谱流出曲线上突起的部分。
当单个组份从柱中流出时,检测器响应信号的记录。
色谱峰的特点:
如果进样量很小,浓度很低,在吸附等温线的线性范围内,色谱峰如果对称,可用Gauss正态分布函数表示:
c:
不同时间t时某物质的浓度,σ:
标准偏差,c0:
进样浓度,t:
保留时间
3、色谱流出曲线的用途
①根据色谱峰的个数,可以判断样品中所含组份的最少个数。
②根据色谱峰的保留值(或位置)定性。
③根据峰面积(峰高)定量。
④色谱峰的保留值及其区域宽度,是评价色谱柱分离效能的依据。
⑤色谱峰两峰间的距离,是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。
4、基线(baseline):
在色谱分析中,当只有流动相通过而没有样品通过检测器时,记录所得到的检测信号随时间变化的曲线,应为一条直线。
5、峰高((peakheight,h):
色谱峰顶点与基线之间的垂直距离
(二)、保留值
1、死时间(tM):
指不被固定相吸附或溶解的气体,从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需时间。
2、死体积(VM)=tMF0指柱子在填充后,色谱柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间检测器的空间的总和。
3、保留时间(tR):
指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需时间。
4、调整保留时间(tr′):
扣除死体积后的保留体积
tr′=保留时间(tr)-死时间(t0)
5、保留体积(Vr):
指从进样开始到被测定组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相(载气)体积。
6、相对保留值(r2,1):
一种物质与另一种物质调整保留值之比。
意义:
两组分热力学平衡分配的差别的度量。
影响因素:
柱温(T)、固定相的性质。
用途:
定性:
一定色谱条件下,两组分的相对保留值是常数。
选择固定相:
r2,1值大,tr大;r2,1值小,tr小。
(三)、区带宽度/区域宽度:
(ZoneBroadeningorBandBroadening)
数理统计用s来度量Gaussian曲线的宽度。
表达方式:
标准偏差,半峰宽度,峰底宽度
1、标准偏差(s):
0.607h处一半的峰宽。
2、半峰宽度(W1/2):
峰高一半处的峰宽度
W1/2=2s(2ln2)1/2=2.354s
单位:
mm或cm;时间min或s;体积。
3、峰底宽度(W):
色谱峰两侧的转折点所作切线在基线上的截距。
Y=4s
三、色谱分析的基本原理
本节内容:
色谱分析过程
塔板理论(platetheory)
速率理论(ratetheory)
色谱分离基本方程式
(一)、色谱分析过程
分离:
基于物质溶解度、吸附能力、立体结构和离子交换等物化性质和结构上的微小差异,使其在流动相和固定相之间的作用力大小或强弱不同,当两相作相对运动时,组分在两相间进行连续多次分配,从而达到彼此分离的目的。
分析:
利用组分的物理和化学性质(光学性质、电学性质、热学性质和化学显色反应等),设计各种检测器,对分离组分连续检测。
气固色谱:
流动相是气体,固定相是固体,组分性质不同,吸附能力不同,差速运动
气液色谱:
流动相是气体,固定相是液体
过程:
载气+试样组分→溶解到固定相→
载气流动→组分挥发→
载气流动组分再溶解→
载气流动→再挥发
→反复过程
分配过程:
组分在固定相和流动相之间发生的多次溶解挥发的过程
(二)、气相色谱基本原理:
在气液色谱中,被测物质各组分的分离是基于各组分在固定液中溶解度的不同。
当试样由载气携带进入色谱柱后,即被固定液所溶解。
随着载气继续流经色谱柱,溶解在固定液中的被测组分又从固定液中挥发出来到气相中去。
随着载气的流动,挥发到气相中的被测组分又会溶解在前面的固定液中。
这样反复多次溶解、挥发,再溶解、再挥发。
由于各组分在固定液中的溶解能力不同,溶解度较大的组分较难挥发,逐渐移在后面;而溶解度较小的组分,则移在了前面,经过一段时间之后,各组分就彼此分离了。
1、分配系数:
在一定温度下组分在两相之间分配达到平衡时的浓度比.
组分保留程度的量度:
K值小,先出柱子,K值大,后出柱子
影响因素:
K只与固定相和温度有关,与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。
2、分配比(partitionratio)/容量因子(capacityfactor)/容量比(capacityratio)
在一定温度、压力下,在两相间达到分配平衡时,组分在两相中的质量比。
物理意义:
k值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的容量大,因此又称分配容量或容量因子。
用途:
衡量色谱柱对被分离组分保留能力。
容量因子越大,保留时间越长;
影响因素:
组分及固定相热力学性质。
柱温、柱压,流动相,固定相的体积。
3、分配系数K与分配比k的关系
相比率β:
反映各种色谱柱型特点的参数
例如:
填充柱,其β值一般为6~35;毛细管柱,其β值为60~600。
分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数,随分离柱温度、柱压的改变而变化;
分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数,数值越大,该组分的保留时间越长;
分配比可以由实验测得。
四、色谱分离的基本理论
(一)、塔板理论(platetheory)
1952年,Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔,用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。
塔板是从精馏中借用的,是一种半经验理论,但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。
塔板理论假设:
在每一块塔板上,溶质在两相中很快就达到平衡,然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移,而导引出一个描述色谱流出曲线的数学表示式:
色谱分离过程-----蒸馏过程,柱子-----分馏塔,柱子=塔板+塔板+塔板+…
★塔板数(n):
组分在柱子中经过分配平衡的次数
★塔板高度(H)(HEPT,heightequivelenttoonetheoreticalplate):
组分在柱子中经过一次分配平衡所需要的柱长
★塔板理论假设:
1)塔板之间不连续;
2)塔板之间无分子扩散;
3)组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡,达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H;
4)某组分在所有塔板上的分配系数K相同;
5)流动相以不连续方式加入,即以一个一个的塔板体积加入。
〖例〗:
设色谱柱由5块塔板(n=5,n为柱子的塔板数)组成,以r表示塔板编号,r=1,2,3,4(n-l);某组分的分配比k=1.该组分的分布可计算如下:
有单位质量,即m=1(例1μg)的该组分加到第0号塔板上,分配平衡后,由于k=1,即ms=mm,故ms=mm=0.5。
当一个板体积(lΔV)的载气以脉动形式进入0号板时,就将气相中含有mm部分组分的载气顶到1号板上,此时0号板液相(或固相)中ms部分组分及1号板气相中的mm部分组分,将各自在两相间重新分配。
故0号板上所含组分总量为0.5,其中气液(或气固)两相各为0.25,而1号板上所含总量同样为0.5.气液(或气固)相亦各为0.25。
以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时,上述过程就重复一次。
按上述分配过程,对于n=5,k=1,m=1的体系,随着脉动进入柱中板体积载气的增加,组分分布在柱内任一板上的总量(气液两相中的总质量)。
由塔板理论可建立流出曲线方程:
当板数很高时,以体积或时间或距离为变数,流出组分浓度变化的方程:
式中:
c—不同时间t时某物质的浓度,c0—进样浓度,tr—保留时间,σ—标准偏差。
n理论塔板数,m组分质量,V保留体积
当V=Vr时,c值最大
结论:
当塔板数n较少时,组分在柱内达分配平衡的次数较少,流出曲线呈峰形,但不对称;
色谱峰为正态分布:
当塔板数n>50时,峰形接近正态分布。
理论塔板数:
根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数n的公式,用以评价一根柱子的柱效。
由于色谱柱并无真正的塔板,故塔板数又称理论塔板数:
理论塔板数由组分保留值和峰宽决定
★理论塔板数
★塔板高度
〖例〗已知某组分峰的峰底宽为40s,保留时间为400s,计算此色谱柱的理论塔板数。
解:
tr=400s,W=40s
n=16(tR/Y)2=16´(400/40)2=1600块
★有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff
由于死时间tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,所以,将t0扣除
★有效塔板高度
色谱柱效能¾描述当溶质流经色谱柱时谱带展宽速率:
★塔板理论实际指导意义:
塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程,导出流出曲线的数学模型,解释了流出曲线形状和位置,提出了计算和评价柱效的参数。
n或H:
描述柱效能的指标,当塔板数增加,塔板高度减小,柱效增加,色谱峰W越小,n就越大,而H就越小,柱效能越高。
(1)当色谱柱长度一定时,塔板数n越多(塔板高度H越小),被测组分在柱内被分配的次数越多,柱效能则越高。
(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同,说明柱效时,必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等;(3)应定期对柱效进行评价,以防柱效下降、延长柱寿命。
(4)柱效不能反应被分离组分的实际分离效果,当两组分的分配系数K相同时,无论该色谱柱的塔板数多大,都无法分离。
(5)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果,无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。
★塔板理论的成就:
流出曲线的形状,浓度极大,计算、评价柱效能,
塔板理论的缺陷:
纵向扩散不能解释造成峰形或谱带扩张的原因,影响板高的各种因素,载气流速u~塔板数n关系
(二)、速率理论:
1956年,荷兰化学工程师VanDeemter提出了色谱过程动力学速率理论:
吸收了塔板理论中的板高H概念,考虑了组分在两相间的扩散和传质过程,从而给出了vanDeemter方程:
色谱过程动力学理论---范第姆特方程
塔板高度=涡流扩散项+分子扩散项+传质阻力项
该式从动力学角度解释了影响板高(柱效)的各种因素!
任何减少方程右边三项数值的方法,都可降低H,从而提高柱效。
1、涡流扩散项(eddydiffusionterm)
在填充色谱柱中,当组分随流动相向柱出口迁移时,流动相由于受到固定相颗粒障碍,不断改变流动方向,使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动。
引起色谱峰的展宽/扩张。
因填充物颗粒大小及填充的不均匀性
——同一组分运行路线长短不同,——流出时间不同,——峰形展宽。
展宽程度以A表示:
A=2λdp
★影响因素
dp:
填料平均直径的大小,λ:
固定相填充不规则因子,固定相颗粒越小dp↓,填充的越均匀,塔板高度H↓,柱效n↑。
★谱图现象:
在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻,色谱峰较窄。
★意义:
与填充物的平均颗粒直径的大小有关;与填充的不均匀性有关。
与流动相的性质、线速度和组分性质无关。
提高柱效,固定相使用细而均匀的颗粒,填充均匀。
毛细管,不存在涡流扩散。
A=0。
2、分子扩散项/纵向扩散项
由于试样组分浓度梯度,使运动的分子产生纵向扩散,它随着流动相向前推进,“塞子”自发地向前和向后扩散,造成谱带展宽。
B/u—分子扩散项
★原因
(1)存在着浓度差,产生纵向扩散;
(2)扩散导致色谱峰变宽,H↑(n↓),分离变差;(3)分子扩散项与流速有关,流速↓,滞留时间↑扩散↑。
B=2γDg
γ:
弯曲因子。
填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素,意义:
固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍。
Dg:
组分在流动相中扩散系数(cm2•s-1)。
与组分和载气性质有关,组分相对分子质量大的,Dg小,载气分子质量大的,Dg小
3、传质阻力项
物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过程,称为传质。
影响这个过程进行速度的阻力,叫传质阻力。
对于气液色谱,传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项,即
C=Cg+Cl
传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL
即:
C=(Cg+CL)
k:
容量因子;Dg:
气体扩散系数,DL:
液体扩散系数
★气相传质过程:
指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。
这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换,即进行浓度分配。
有的分子还来不及进入两相界面,就被气相带走;有的则进入两相界面又来不及返回气相。
这样,使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡,引起滞后现象,从而使色谱峰变宽。
对于填充柱,气相传质阻力系数Cg。
气相传质阻力与填充物粒度平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数成反比。
意义:
用粒度小的填充物相对分子质量小的气体(如氢气)做载气,Cg减小,提高柱效。
降低传质阻力办法:
减小担体粒度,选择小分子量的气体作载气
★液相传质阻力系数C1为
固定相的液膜厚度df薄,
组分在液相的扩散系数D1大,则液相传质阻力就小。
液膜厚度:
降低固定液的含量,可以降低液膜厚度,但k值随之变小,又会使C1增大。
当固定液含量一定时,液膜厚度随载体的比表面积增加而降低,因此,一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度,但比表面太大,由于吸附造成拖尾峰,也不利分离。
柱温:
虽然提高柱温可增大Dl,但会使k值减小,为了保持适当的Cl值,应控制适宜的柱温。
气液色谱速率板高方程
H=A+B/u+Cgu+Clu
★速率理论的要点
(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。
(2)通过选择适当的固定相粒度、流动相种类及流速可提高柱效。
柱子:
填充担体的细度
流动相:
氮气N2,氢气H2,氦气Ne
流速:
填充柱:
50ml/min,毛细管柱:
1ml/min
(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。
阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。
(4)各种因素相互制约,
如流动相流速增大,分子扩散项的影响减小,使柱效提高,但同时传质阻力项的影响增大,又使柱效下降;柱温升高,有利于传质,但又加剧了分子扩散的影响。
实际指导意义:
对柱效的影响,色谱柱填充的均匀程度,填料颗粒的大小,流动相的种类及流速,固定相的液膜厚度等。
五、分离度
理论需要解决的问题:
塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。
即柱效为多大时,相邻两组份能够被完全分离。
难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响:
保留值之差──色谱过程的热力学因素;区域宽度──色谱过程的动力学因素。
1.两组份峰间距足够远:
由各组份在两相间的分配系数决定,即由色谱过程的热力学性质决定。
2.每个组份峰宽足够小:
由组份在色谱柱中的传质和扩散决定,即由色谱过程动力学性质决定。
色谱分离中的四种情况:
①柱效较高,△K(分配系数)较大,完全分离;②△K不是很大,柱效较高,峰较窄,基本上完全分离;③△K较大,柱效较低,但分离的不好;④△K小,柱效低,分离效果更差。
(a)两峰严重相叠,这表示选择性和柱效都差。
(b)虽然两峰距离拉开了,但峰形仍很宽,说明选择性好,但柱效低。
(c)分离最理想,说明选择性好,柱效也高。
柱效和选择性
色谱过程动力学性质:
柱效--理论塔板数表示
色谱过程组分在固定相上的热力学性质:
色谱柱的选择性--色谱图上的两峰间的距离表示,距离大,选择性好,用相对保留值表示
峰宽分离度:
相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值,
当R<1时,两峰有部分重叠;当R=1时,分离程度可达98%;当R=1.5时,分离程度可达99.7%。
作为相邻两组分已完全分离的标志
六、色谱分离基本方程式
分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标.分离度¾总分离效能指标
分离度R的定义并没有反映影响分离度的诸因素。
分离度受柱效(n)、选择因子(α)和容量因子(k)三个参数的控制。
与柱效能、选择性、容量因子的关系
1.分离度与柱效(n)的关系,降低H--提高R
2.分离度与容量比(k)的关系,1~10。
K大,R大,时间长
3.分离度与柱选择性(α)的关系,α大,分离效果好,一对最难分离物质:
α=tr2’/tr1’>1
第八章气相色谱流程与结构
一、气相色谱仪的结构
气相色谱仪由五大系统组成:
1.气路系统
气相色谱仪的流动相多用高压气瓶做气源,经减压阀把气瓶中15MPa左右的压力减低到0.2~0.5MPa,通过净化器(一般为20~25cm×4cmi.d.的金属管或塑料管,内装5A分子筛,除去载气中的水分和杂质)到稳压阀,保持气流压力稳定。
程序升温用气相色
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