分解纤维素的微生物的分离(2.25).ppt

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分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物的分离的分离目标目标:

11、知道纤维素酶的种类及作用、知道纤维素酶的种类及作用22、初步掌握从土壤中分离出分解、初步掌握从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验方法纤维素的微生物的实验方法纤维素与纤维素酶1.纤维素一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。

一、基础知识一、基础知识植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。

其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。

思考：

纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？

纤维素能被土壤中某些微生物分纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生解利用，这是因为它们能够产生纤维纤维素酶素酶。

土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。

在草食性动物的消化道内，共生有分解纤维素的微生物，其产生纤维素酶而分解纤维素。

人没有分解纤维素的能力。

人类可应用分解纤维素的微生物将秸人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。

服装面料等。

草食性动物是怎样消化纤维素的？

草食性动物是怎样消化纤维素的？

下列生物能分解纤维素的是（下列生物能分解纤维素的是（）人人兔兔牛牛蘑菇蘑菇纤维杆菌纤维杆菌A.B.C.D.C即：

能分解即：

能分解纤维素纤维素的微生物有各种细菌、的微生物有各种细菌、真菌和少数放线菌，动物则为草食性动物。

真菌和少数放线菌，动物则为草食性动物。

2.2.纤维素酶纤维素酶一种一种复合酶复合酶，它，它至少包括三种组至少包括三种组分分，即，即CC11酶、酶、CCXX酶酶和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶。

纤维二糖纤维二糖CC11酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：

实验：

纤维素酶分解纤维素的实验纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的的醋酸醋酸钠缓冲液醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：

乙试管的滤纸条消失结果：

乙试管的滤纸条消失讨论讨论：

乙试管的滤纸条为什么会消失？

甲试管的作用是：

乙试管的滤纸条为什么会消失？

甲试管的作用是什么？

什么？

自变量：

纤维素酶的有无自变量的控制：

乙试管-1mL纤维素酶溶液甲试管-等量的缓冲液（不能加蒸馏水，会影响溶液的pH）。

实验分析：

实验分析：

PP2727的小实验是如何构成对照？

的小实验是如何构成对照？

（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法是_。

该方法可以通过_反应直接筛选。

刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色22、其原理是：

刚果红可以与纤维、其原理是：

刚果红可以与纤维素形成素形成_，当纤维素被，当纤维素被_分解后，红色复合物无分解后，红色复合物无法形成，出现以法形成，出现以_为为中心的中心的_，我们可以通过，我们可以通过_来筛选纤维素分解菌。

来筛选纤维素分解菌。

红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈练一练：

练一练：

1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A.刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴将样品涂布到鉴别纤维素分解菌别纤维素分解菌的培养基上的培养基上挑选产生挑选产生透明圈的透明圈的菌落菌落分布环境分布环境1.1.土壤取样：

土壤取样：

富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中操作步骤操作步骤生物与环境的互相依存关系生物与环境的互相依存关系，在富含，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

的几率要高于普通环境。

原因原因实例：

树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积实例：

树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。

累的枯枝败叶等。

讨论讨论:

如果找不到合适的环境，可以将如果找不到合适的环境，可以将滤纸滤纸埋在土壤中。

埋在土壤中。

将将滤纸滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。

一般应菌生存的适宜环境。

一般应将滤纸埋于深将滤纸埋于深约约10cm10cm左右的土壤中左右的土壤中。

22、选择培养、选择培养增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。

样品中分离所需要的微生物。

目的：

目的：

制备选择培养基：

制备选择培养基：

操作：

操作：

将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养温度下震荡培养12天，直至天，直至培养液变浑培养液变浑浊浊。

也可重复选择培养。

也可重复选择培养。

在选择培养的条件下，可以使那些在选择培养的条件下，可以使那些能够能够适应适应这种营养条件的微生物得到这种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那些，而那些不适应不适应这种营养条这种营养条件的微生物的繁殖被件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此可以，因此可以起到起到“浓缩浓缩”的作用。

的作用。

为什么选择培养能为什么选择培养能“浓缩浓缩”所需的微生物？

所需的微生物？

培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主提供主要营要营养物质养物质纤维素粉纤维素粉5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl0.5g，Na2HPO47H2O1.2gKH2PO40.9g，MgSO47H2O0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏0.5g生长因子、碳源、生长因子、碳源、氮源氮源水水解酪素解酪素0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水提示：

可用提示：

可用牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基与之对照培养基与之对照,或者将或者将纤维素改为葡萄糖纤维素改为葡萄糖。

A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？

为什么？

B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？

是如何进行选择的？

C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？

本实验的流程与课题本实验的流程与课题22中的实验流程有哪些异同？

中的实验流程有哪些异同？

课题课题22是将土样制成的是将土样制成的菌悬液菌悬液直接直接涂布涂布在以尿素为唯一氮源的在以尿素为唯一氮源的选择性培选择性培养基养基上，上，直接分离直接分离得到菌落。

得到菌落。

本课题本课题通过通过选择培养选择培养，使纤维素，使纤维素分解菌得到分解菌得到增殖增殖后后，再再将菌液将菌液涂布涂布在在鉴别培养基鉴别培养基上上。

其他步骤基本一致。

其他步骤基本一致。

思考：

思考：

说明：

说明：

分析分析“纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。

只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，繁殖。

只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。

只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。

比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌培养在只有将细菌培养在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养，增加浓度选择培养，增加浓度按照课题按照课题11的稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释101011101077倍。

倍。

3.3.梯度稀释梯度稀释1011021031041051064.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养的培养基上基上制备培养基制备培养基:

参照课本旁栏中的比例配制。

参照课本旁栏中的比例配制。

倒平板操作倒平板操作。

涂布平板：

涂布平板：

将稀释度为将稀释度为104106的菌悬液各的菌悬液各取取0.1ml涂布到平板培养基上，涂布到平板培养基上，30倒置培养。

倒置培养。

挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落（参照课本刚果红染参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落色法，挑选产生透明圈的菌落,即为分解纤维素即为分解纤维素的菌落的菌落.）培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na510g碳源碳源酵母膏酵母膏1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL水水鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基（水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠）方法一：

先方法一：

先，再加入刚果红进，再加入刚果红进行颜色反应。

行颜色反应。

方法二：

在方法二：

在时就加入刚果红。

时就加入刚果红。

培养微生物培养微生物倒平板倒平板5.刚果红染色法刚果红染色法挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。

纤维素的菌落。

这两种方法各有哪些优点与不足？

这两种方法各有哪些优点与不足？

染色法染色法染色法染色法优优点点点点缺点缺点缺点缺点方法一方法一方法一方法一方法二方法二方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发生刚果红会使菌落之间发生混杂混杂操作简便不操作简便不存在菌落混存在菌落混杂问题杂问题1.1.产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈产生模糊透明圈2.2.有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。

形成明显的透明圈。

方法一中方法一中NaCl溶液的作用？

溶液的作用？

思考：

思考：

漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清不够清晰。

晰。

比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。

在培升高。

在培养基中加入