发酵产生氨基乙酰丙酸科氏葡萄球菌筛选.docx
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发酵产生氨基乙酰丙酸科氏葡萄球菌筛选
发酵产生5-氨基乙酰丙酸的科氏葡萄球菌的筛选1
发酵产生5-氨基乙酰丙酸的科氏葡萄球菌的筛选[收稿日期:
作者简介:
张龙涛(1979-),男,博士,副研究员,从事生物活性物质开发研究
通讯作者:
冯玉兰(1941-),女,研究员,从事动物营养与饲料资源开发研究(E-mail:
faasfyl@163);刘波(1957-),男,研究员,博士,主要从事生物技术研究(E-mail:
fzliubo@163)
基金项目:
福建省属公益类科研院所基本科研专项(2010R1025-4)、福建省自然科学基金2010J01106、
福建省科技重大专项(2010NZ0002-3)资助]
张龙涛1,李昂3,曹宜2,朱育菁2,缪伏荣1,冯玉兰*1,刘波*2
(福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州,350013;2.福建省农业科学院农业生物资源研究所,福州,350003;3.中国石油天然气第七建设公司,胶州,266300)
摘要:
筛选得到一株可生产5-氨基乙酰丙酸(ALA)的细菌LA-10,21h摇瓶发酵ALA产量达6.88mg.L-1。
在常规生理生化特性测定基础上,结合16SrDNA序列分析鉴定为科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii),命名为科氏葡萄球菌LA-10。
关键词:
5-氨基乙酰丙酸;科氏葡萄球菌;筛选;发酵
ScreeningofStaphylococcuscohniiforbioproductionof5-aminolevulinicacid
ZHANGLong-Tao1,LIAng3,CAOYi2,ZHUYu-jing2,MIAOFu-rong1,FENGYu-lan*1,LIUBo*2
1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,350013;2.AgriculturalBio-ResourceResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,350003;3.ChinaPetroleum7thConstructionCompany,Jiaozhou,266300,China
Abstract:
AstrainnumberedasLA-10producing5-aminolevulinicacidwasscreenedfromthestromacushionofpiggery.ThestrainwasidentifiedasStaphylococcuscohniibasedonthemorphous,biological,biochemicalcharacteristics,and16SrDNAanalysis.ItwasnamedStaphylococcuscohniiLA-10Keywords:
5-aminolevulinicacid;Staphylococcuscohnii;screening;fermentation
前言
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid,简写ALA,下同)是生物体内合成四吡咯化合物(卟啉、叶绿素、血红素和维生素B12)生物合成的前体物质,是生物调节合成四吡咯物质的关键中间物,广泛存在于微生物、植物和动物细胞中[1]。
ALA主要用于作为一种环境无残留的除草剂[2]和杀虫剂[3]、植物生长促进剂[4]及作为第二代光动力学药物用于治疗癌症和其他疾病[5,6]。
目前ALA的主要使用化学法合成,其具有合成步骤繁琐、副产物毒性大、得率较低等突出问题[7]。
微生物合成ALA工艺简单,产率高,具有工业化生产的潜力,因此近年来受到了广泛关注。
用微生物法制备ALA的的研究已经有20余年的历史,但迄今为止,仅有为数不多的几种微生物被发现具有生物法制备ALA的功能,包括Rhodobactersphaeroides[8]、Rhodovulumsp.[9]、Rhodopseudomonaspalustris[10]、Propionibacteriumacidipropionici[11]、Chlorellasp.[12]、Chlorellaregularis[13]和基因工程菌[14,15,16,17,18,19,20]。
因此筛选新的微生物菌种进行生物法制备ALA成为研究者的新任务。
本文尝试从自然界筛选可产ALA的细菌,为进一步研究生物法制备ALA提供新材料,开拓新途径。
1材料与方法
1.1土壤样品采集
30份土壤样品2008年9-10月采自福州各地池塘淤泥、猪舍垫料等。
1.2培养基
分离培养基(g.L-1):
酵母浸膏5,胰蛋白胨10,NaCl5,琼脂1.8;初始pH值6.0;50ug.mL-1制霉菌素。
保存培养基(g.L-1):
胰蛋白胨10、酵母浸膏4、葡萄糖2、硫酸镁1、磷酸氢二钠1、琼脂1.8。
发酵培养基(g.L-1):
葡萄糖5、酵母浸膏3、氯化钠1、磷酸氢二钠1、磷酸二氢钠1、硫酸镁1、初始pH值6.0。
1.3主要试剂
ALA盐酸盐标准品(97%,sigma公司),其余试剂均为分析纯。
1.4菌株分离筛选方法
将取得的各种土样各称取约10g,分别悬浮于0.9%NaCl溶液中,用8层纱布过滤去除较大的杂质颗粒,接种至分离培养及平板,30°C培养24h,挑选单菌落,LB平板划线二次培养,得到单菌落后,接种发酵培养基进行摇瓶发酵,发酵液离心取上清,分光光度法测定ALA含量。
1.5分光光度法测定ALA含量1.5.1ALA标准曲线的制备
(1)精确配制浓度为1、2、4、5、8、10mg.L-1的ALA标准溶液。
(2)在10mL具盖的离心管中加入2mL不同浓度的标准ALA溶液、0.5mL乙酰丙酮和1mL的乙酸钠缓冲液,沸水浴15min,冷却至室温后,加Ehrlich’s显色剂2mL显色30min,以水为空白测554nm处的吸光度[21]。
(3)以ALA浓度为纵坐标,A554吸光值为横坐标,作标准曲线。
1.5.2样品的测定
取待测液2mL,依次加入1mL浓度为2mol.L-1的乙酸钠缓冲液(pH4.6)和0.5mL乙酰丙酮,沸水浴15min。
冷却至室温后,取2mL反应液与2mLEhrlich’s试剂反应,30min后使用分光光度计在以水为空白,测554nm处的吸光值。
根据标准曲线计算浓度,再乘以稀释倍数,即可得到样品中ALA的浓度。
1.616SrDNA序列的测定
16s1:
5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
16s2:
5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
所用的引物(16s1/16s2)由上海博尚生物技术有限公司合成。
反应体系:
取DNA模板5ng,STR缓冲液2μL,引物各100ng,dNTPs2μL,TaqDNA聚合酶0.1μL,补无菌水至20μL。
温度循环参数:
94°C预变性2min,然后94°C1min,55°C退火1min,72°C延伸1min,共30个循环,72°C延伸5min。
用Qiagen胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物后0.7%(w/v)琼脂糖凝胶检测,DNA回收试剂盒回收目标片断。
16SrDNA测序由大连宝生物工程有限公司完成。
1.7分离菌株的形态学特征和碳源利用试验
将单菌落接种到LB平板上,于30°C培养24h,记录其菌落形态;显微镜观察菌体形态及大小。
使用APISTAPH鉴定系统对菌株进行生理生化特性测定
2结果与讨论
2.1筛选结果
从二次划线平板上随机挑取不同菌落形态的菌株50个,接种发酵培养基,250mL三角瓶装液量50mL,30°C,150rpm摇床培养。
12h开始,每3h对发酵液取样,离心上清测定ALA含量。
结果如表1所示,经过初筛,共分离获得4株能产ALA的细菌。
发酵液中ALA含量达到:
1.56-6.88mg.L-1,其中LA-10最高,21h发酵中ALA浓度达到6.88mg.L-1。
后续工作对LA-10进行菌种鉴定。
表1各菌株ALA生产能力
Table1BioproductioncapacityforALAofscreenedstrains
菌株编号ALA峰值浓度(mg.L-1)达峰值浓度时间
LA-021.5620h
LA-043.9936h
LA-072.7930h
LA-106.8821h
2.2菌株LA-10的生理生化特征
该菌革兰氏染色呈阳性,在LB平板上为中等大小,湿润,乳白色。
生理生化特性测定结果表明(见表2),LA-10对D-葡萄糖、D-果糖、麦芽糖、乳糖、D-海藻糖、D-甘露醇、β-萘酚-酸性磷酸盐、VP试验均为阳性;对D-甘露糖、木醇、D-蜜二糖、棉子糖、木糖、蔗糖、α-甲基-D-葡萄糖甙、N-乙酰-葡萄糖胺、硝酸钾、精氨酸、尿素均为阴性。
LA-10基本符合科氏葡萄球菌的生理生化特征[22,23]
表2菌株LA-10生理生化特性测定结果
Table2PhysiologicalandbiochemicalcharactersofLA-10
检测项目LA-10
D-葡萄糖+
D-果糖+
D-甘露糖-
麦芽糖+
乳糖+
D-海藻糖+
D-甘露醇+
木醇-
D-蜜二糖-
棉子糖-
木糖-
蔗糖-
α-甲基-D-葡萄糖甙-
N-乙酰-葡萄糖胺-
KNO3-
β-奈酚-酸性磷酸盐+
丙酮酸钠+
精氨酸-
脲素-
注:
“+”表示阳性反应,“-”表示阴性反应
2.3菌株LA-10的16SrDNA序列测定
LA-10的16SrDNA测序结果经拼接后提交GenBank,全长1488bp,登录号JX455744。
序列BLAST结果表明,LA-10与Staphylococcuscohnii同源性最高,与StaphylococcuscohniiCV3816SrDNA序列同源性达99%。
依据形态学,生理生化特性,结合16SrDNA序列比对结果,可将LA-10初步鉴定为科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii),拟命名为StaphylococcuscohniiLA-10。
3结论与展望
筛选得到可发酵产生ALA的科氏葡萄球菌LA-10,为生物法制备ALA提供了新材料。
目前未见关于葡萄球菌生产ALA的相关报道,因此,对于该菌生产ALA的机理、发酵条件优化、基因克隆表达等都有待更深一步的研究。
参考文献
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附注:
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zlongtao@hotmail,zhanglongtao@rohesen
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