Northern实验方法.docx

Northern实验方法.docx

《Northern实验方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Northern实验方法.docx（25页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

Northern实验方法

Northern Blot实验方法

[仪器、试剂、材料]

（一）仪器

恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。

（二）材料

总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA（25ng），尼龙膜

（三）试剂

NorthernMaxKit（Cat.#1940，Ambion,Inc.），琼脂糖，DEPC,X光底片，底片暗盒，RandomPrimer，dNTPMixture，111TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-freeKlenowFragment和10XBuffer,SephadexG-50,SDS，双氧水,灭菌水等。

[方法与步骤]

1.用具的准备：

180度烤器皿：

三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：

清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

处理DEPC水（2L）备用。

2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

3．制胶：

1）称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。

60℃空气浴平衡溶液（需加DEPC水补充蒸发的水分）

2）在通风厨中加入3.6ml的10＊DenaturingGelbuffer，轻轻振荡混匀。

注意尽量避免产生气泡。

3）将熔胶倒入制胶板中，插上梳子

如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。

注：

胶的厚度不能超过0.5cm。

4）胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1xMOPSGelRunningbuffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。

（配制250ml　1＊MOPSGelRunningbuffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。

）

5）检查点样孔。

4.RNA样品的制备

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehydeloaddye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。

混匀后，65℃空气浴15min。

短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

5.电泳：

1）将RNA样品小心加到点样孔中。

2）在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。

在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。

当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。

3）紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。

注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

6.转膜

1）用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。

2）用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。

3）连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transferbuffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。

4）盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。

5）将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。

6）将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。

7）打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transferbuffer加到胶面和四周。

每隔10min在胶面加上1mltransferbuffer，真空转移2小时。

8）转膜后，用镊子夹住膜，于1xMOPSGelRunningbuffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。

9）用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。

10）将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。

（避免太长的紫外曝光时间）

12）将膜在-20℃保存。

7.探针的制备

1．在1.5ml离心管中配制以下反应液：

模板DNA（25ng）　　　　1ul

RandomPrimer2ul

灭菌水11ul

总体积：

14ul

2．95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。

3．在离心管中按下列顺序加入以下溶液：

10×Buffer2.5ul

dNTPMixture2.5ul

111TBq/mmol[a-32P]dCTP5ul

Exo-freeKlenowFragment1ul

4．混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。

短暂离心，收集溶液到管底。

5．65°C加热5min使酶失活。

8.探针的纯化及比活性测定：

1．准备凝胶：

将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。

用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。

换用新配制的TE（PH7.6）。

2．取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填SephadexG-50凝胶。

3．将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。

1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加SephadexG-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处

4．100ulSTE缓冲液洗柱，1600g离心4min。

重复3次。

5．倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了SephadexG-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。

6．将标记的DNA样品加入25ulSTE，取出0.5ul点样于DE8　paper上，其余上样于层析柱上。

7．1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。

取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.

8．测比活性（试剂比活要求:

106cpm/ml）。

9．预杂交：

1．将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。

2．加入适当的ULRAhyb到杂交管中（以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb杂交液），42℃预杂交4hr。

10．探针变性：

1．用10mMEDTA将探针稀释10倍。

2．90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。

3．短暂离心，将溶液收集到管底。

11．杂交：

1．加入0.5mlULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。

2．42℃杂交过夜（14~24hr）。

杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。

12．洗膜：

1．低严紧性洗膜：

加入LowStringencyWashSolution#1（100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液），室温下，摇动洗膜5min两次。

2．高严紧性洗膜：

加入HighStringencyWashSolution#2（100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液），42℃摇动洗膜20min两次。

13．曝光：

1．将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。

2．检查膜上放射性强度，估计曝光时间

3．将X光底片覆盖与膜上，曝光

4．冲洗X光底片，扫描记录结果。

14．去除膜上的探针：

将200ml　0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。

15．杂交结果

操作应该小心，但不必紧张。

用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse酶，以免样品的降解。

转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡

Northern杂交

1．在10~20ml预杂交液中68℃温育膜2h。

2．若使用双链探针，在100℃下加热32P标记的双链DNA5min，使之变性，然后迅速移至冰水中冷却。

3．把变性的或单链放射性标记的探针直接加到预杂交液中，在合适的温度下继续温育12~16h。

4．杂交后，将膜从塑料袋中取出，在室温下迅速转移到含有100~200ml1×SSC，0.1%SDS的塑料盒内，将盒盖好，置于水平振荡器上，温和振荡10min。

5．将膜转移至另一含有100~200ml预热至68℃、含0.1%SDS的0.5×SSC的塑料盒中。

68℃下温和振荡10min。

6．重复步骤5，再洗涤至少2次，使68℃下共洗涤3次。

7．在印迹纸上晾干膜，然后让膜于-70℃下在含增感屏的暗盒内对X线片（KodarXAR-5或相应的胶片）放射自显影24~48h。

此外，也可通过磷图像系统扫描得到膜上的图像。

经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳

　　这一方法原于McMaster和Carmichael（1977）。

含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。

尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。

1）在灭菌的离心管内，混匀下列液体：

6mol/L乙二醛5.4μl

DMSO16.0μl

0.1mol/L磷酸（pH7.0）3.0μl

RNA（多达10μl）5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。

由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-RadAG501-X8对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。

每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。

0.1mol/L磷酸钠（pH7.0）的配法如下：

将3.9ml1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml1mol/L磷酸氢二钠和90ml水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。

每一泳道至多可分析10μgRNA，通常用10-20μg细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μgpoly（A）+RNA。

2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。

3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4％琼脂糖分析1kb以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb以上的RNA样品。

用0mmol/L磷酸钠（pH7.0）后，降温至70℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。

用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H2O2，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。

因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。

4）将RNA样品冷却至0℃，加入4μl灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛－DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。

用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28SrRNA或或9S兔β－珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2366和710个碱基。

也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。

通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。

乙二醛－DMSO凝胶加样缓冲液

50％甘油

10mmol/L磷酸钠（pH7.0）

0.25％溴酚蓝

0.25％二甲苯青FF

5）将凝胶浸入10mmol/L磷酸钠电泳液中，以3－4V/cm电压降进行电泳，同时按图7.1对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液pH值维持在可被接受的限度内（pH>8.0时乙二醛将从PNA分子上解离）。

另一方法为电泳时每30分钟换一次磷酸钠缓冲液。

6）电泳结束后（溴酚蓝迁移出区8cm），切下分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液（0.5μg/ml，

用0.1mol/L乙酸铵配制）中染色30-45分钟。

在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RPN片段大小的lg对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的RNA分子的大小。

7）RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，将RNA转移至尼龙膜。

将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜

　　电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：

毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。

毛细管洗脱法如下所述，真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。

尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983），

但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。

如果琼脂糖中浓度大于1％或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。

然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜，RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体（硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。

1）将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。

2）用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿内，上面放一张Whatman3MM滤纸，倒入20xSSC使液面略低于平台表面，当平上方的3MM滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡。

3）用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜（Schleicher＆SchuellBA85或与之相当的产品）。

滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm，接触滤膜时须戴手套或用平头镊子（例如Millipore镊子），用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。

4）将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至滤膜从下向上湿透为止，随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。

不同批号的硝酸纤维膜，其浸湿速率相差悬殊。

如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因为未均匀浸湿的滤膜进行RNA转移是靠不住的。

这种滤膜也不必丢弃，可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，高压5分钟。

通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。

高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间，装入塑料袋，密封后于4℃保存备用。

5）将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。

6）用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。

并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。

7）在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。

滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。

滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝交之间不应留有气泡。

8）用2xSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。

用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。

9）切一叠（5－8cm高）略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方。

并在纸巾上方放一块越境玻璃板，然后用－500g的重物压实。

其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。

10）使上述RNA转移持续进行6－18小时，每当纸巾浸湿后，应换凝的纸巾。

11）转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3MM滤约纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。

12）从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。

以6xSSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟，这一步可以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。

从6xSSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。

于室温晾干30分钟以上。

为估计RNA的转移效率，可将胶置于溴化乙锭溶液（0.5μg/ml，以0.1mol/L乙酸铵配制）中染色45分钟，于紫外灯下观察。

13）将晾干的滤膜放在两经张3MM滤纸中间，用真空炉于80℃干烤0.5-2小时。

如干烤时间过长，滤膜极易脆裂并可能发黄。

如果滤膜并不立即用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来，在真空下贮存于室温。

14）仅适用于滤膜上含有乙醛酰PNA的情况：

杂交前需用20mmol/LTris.Cl（pH8.0）于65℃洗膜，除去RNA上的乙二醛分子。

（三）转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的ＲＮＡ染色

当ＲＮＡ自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降低。

然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶和凝膜上的ＲＮＡ的优点。

１．方法Ｉ

１）电泳结束后，含乙二醛－ＤＭＳＯ的凝胶应浸入含溴化乙锭（0.5μg/ml）的10mmol/L磷酸钠（pH7.0）溶液。

甲醛凝胶需用无ＲＮＡ酶的水淋洗，用20xＳＳＣ溶液浸泡，随后用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的20xＳＳＣ溶液染色。

２）于室温染色５－１０分钟，在紫外灯下观察，照像。

３）按前所述方法，将凝胶中的ＲＮＡ转移至硝酸纤维素滤膜，转移后能常在学光下也可看出已染色的ＲＮＡ条带。

这种方法仅适用于每一泳道均含有相当大量（如５μg以上）的ＲＮＡ的情况。

２．方法Ⅱ

　　硝酸纤维素滤膜上的ＲＮＡ也可以用下述方法染色：

从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带进行染色，也可以用经过杂交并经Ｘ光片曝光后的整张滤膜进行染色（Ａ.Ｅfstratiadis,未了表材料）。

１）将干燥的滤膜浸入５％冰乙酸中，于室温浸泡15分钟。

２）再将滤膜转移至0.5mol/L乙酸钠（pH5.2）、0.04％亚甲蓝溶液中，于室温浸泡５－１０分钟。

３）用水淋洗滤膜５－１０分钟后，可见ＲＮＡ分子量标准参照物带型锐利而poly（A）+mRNA为一模糊带型，由许多长度范围从500碱基以下至５kb以上的各种mＲＮＡ共同组成，mＲＮＡ的平均长度约为２kb。

杂交和放射自显影

固定于滤膜上的RNA的预杂交、杂胶及淋洗等条件，与DNA杂交的相应条件基本相同。

现简述如下

1）用下列两种溶液之一进行预杂交，时间1－2小时。

若于42℃进行，应采用。

50％甲酰胺

5xSSPE

2xDenhardt试剂

0.1％SDS

若于68℃进行，应采用：

6xSSC

2xDenhardt试剂

0.1％SDS

2）在预杂交液中加入变性的放射性标记探针，如欲检测低丰度mRNA，所用探针的量至少为0.1μg，其放射性比活度应大于2x108计数/（分．μg）在适宜的温度条件下继续温育16-24小时。

切记RNA只与双链DNA中一条单链互补，因此如用单链探针，则必须是能与RNA互补的一条单链。

3）用1xSSC、0.1％SDS于室温洗漠20分钟，随后用0.2xSSX、0.1％SDS于68℃洗膜3次每次20分钟。

4）用X光片（KodakXAR－2或与之相当的产品）进行放射自显影，附加增感屏于－17℃曝光24-48小时。

RNA印迹杂交

1）      Northern印迹的制备

预备：

1．按下述步骤，每泳道加10～20μg总RNA或0.5～1μgpoly（A）+RNA进行甲醛/琼脂糖凝胶电泳，将凝胶放在紫外线透照仪上，旁边置一标尺进行拍照。

a.总RNA（10～20μg）用下列溶液在65℃温育5min：

总RNA（10～20μg）

6.0μl

甲酰胺

12.5μl

10×MOPS缓冲液

2.5μl

甲醛溶液（37％）

4.0μl

b.置冰浴迅速冷却，加2.5μl上样缓冲液，并加样于按如下配制的甲醛/琼脂糖凝胶中。

琼脂糖

1.0g

10×MOPS缓冲液

10.0ml

H2O

73.0ml

c.加热至100℃溶解凝胶，然后置50℃水浴箱降温。

加17ml甲醛，混匀并立即倒胶。

须在通风橱内带手套操作，用一电泳槽专供RNA电泳。

Northern印迹

1．当凝胶仍在电泳时，裁一张与凝胶大小相同的滤纸，以20×SSC浸泡。

2．安装转移装置，盘内倒入杂交缓冲液（20×SSC）。

在缓冲液平面上做一平台，将凝胶盘倒置，并盖三张经20×SSC饱和的滤纸（Whatman3MM），平台两端的滤纸应浸入缓冲液中，用10ml的玻璃吸管滚动以赶除气泡并将滤纸推平。

3．在滤纸表面倒入数ml20×SSC，将凝胶倒扣于滤纸上，小心赶除凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布粘贴或用塑料薄膜包裹以防缓冲液直接从凝胶周围流至纸中（虹吸短路）。

4．用数ml20×SSC浸没凝胶，置滤膜于凝胶上，确保凝胶与滤膜之间无气泡。

用软铅笔标记面对凝胶的滤膜面。

5．滤膜表面放三张大小与滤膜相似并预先用20×SSC浸泡的3MM滤纸。

6．放一叠干燥吸水纸（印迹纸或纸巾）在3MM滤纸表面（约5～8cm高）。

7．在折叠纸上放一玻璃板，并在玻璃板上置0.75～1kg重的物体。

8．转移进行12～16小时，确保槽内有足够的20×SSC（约3L）。

9．转印后，小心拆卸印迹装置，将凝胶与滤膜一起转移到干燥滤纸上，凝胶在上。

用软铅笔标记凝胶和滤膜加样孔的位置，撕去凝胶。

10． 以20×SSC漂洗滤膜片刻以去除琼脂糖残迹。

11． 将滤膜放在一块干燥的3MM滤纸上稍微晾干。

12． 固定RNA于滤膜上，将尼龙膜RNA面朝下在紫外透照仪照射3～5min。

13． 此滤膜可用于杂交或4℃保存，尼龙膜需要塑料袋密封。

2）RNA印迹杂交

1．用5×SSPE浸湿RNA滤膜。

2．将浸湿的RNA滤膜转移至塑料袋中，塑料袋四周封口并剪去一角。

3．预热预杂交液至42℃，经塑料袋开口处加入0.1ml/cm2的预热的预杂交液，小心移取，避免加入气泡，从塑料袋中挤压出所有气泡，密封塑料袋。

4．在42℃水浴摇床中温育塑料袋2～4小时，或将塑料袋夹于两块玻璃板中置42℃烤箱2～4h，确保滤膜表面无气泡。

5．置95℃10min使探针变性，立即置冰浴冷却5min。

6．剪去杂交袋一角，将预杂交液倒入15或50ml的Falcon试管中，加入约10～20ng/ml（随机引物标记）探针，一般来说，106～107cpm/ml已足够，轻轻混匀。

用一次性塑料移液管将杂交液加入装有滤膜的塑料袋中。

7．从塑料袋的开口处将气泡全部压出，用纸巾揩去流出的少许杂交液，小心封好袋口，避免液体漏出。

必要的话，可将塑料袋套入另一个塑料袋内以防放射性污染。

8．在42℃水浴摇床中温育12～16h，或夹在两块玻璃板中置42℃烤箱温育12～16h。

9．杂交完毕，打开塑料袋的一角，将杂交液倒入15或50ml的Falcon试管中。

小心不要使放射性溶液溅出。

10． 将塑料袋完全打开，用钝头镊子将滤膜转移至盘中以便清洗，立即用缓冲液（2×SSC，0.1％SDS）1漂洗滤膜。

11． 室温下，用漂洗缓冲液1漂洗三次，每次5min。

12． 室温下，用漂洗缓冲液2（0.25×SSC，0.1％SDS）漂洗两次，每次5min。

13．