浅论TSA对甲状腺鳞癌细胞株SW579增殖的影响.docx
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浅论TSA对甲状腺鳞癌细胞株SW579增殖的影响
浅论TSA对甲状腺鳞癌细胞株SW579增殖的影响
【摘要】目的探讨曲古抑菌素A对甲状腺鳞癌细胞株SW579生长增殖的影响。
方法分别以终浓度为25、50、100、200、400nmol/L的TSA作用于SW579细胞株,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化;采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞的体外增殖、吖啶橙染色荧光显微镜观察细胞形态及细胞凋亡、流式细胞术检测细胞凋亡率的改变。
结果TSA作用后对细胞的增殖有抑制作用;吖啶橙染色后光镜下观察发现有典型的凋亡小体生成;流式细胞仪分析凋亡率随TSA浓度的升高而升高(P<)。
结论不同浓度的TSA可抑制SW579细胞增殖,促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性。
【关键词】曲古抑菌素A甲状腺鳞癌细胞增殖细胞凋亡
Abstract:
ObjectiveTostudytheeffectsoftrichostatinA(TSA)onapoptosisandproliferationofthyroidsquamouscellcarcinomaSW579.MethodsTreatedwithdifferentdosesofTSA(finalconcentrationof25nmol/L,50nmol/L,100nmol/L,200nmol/L,400nmol/L),thecellswereobservedwithaninvertedmicroscope;Theproliferationactivitiesofcelllineweredeterminedbyusingmethylthiazolyltetrazolium(MTT)assay.Cellmorphologiesandapoptoticwereobservedbyfluorescencemicroscopestainedwithacridineorange.Flowcytometrywasadoptedtoexamineapoptoticrate.ResultsTSAinhibitedsignificantlythegrowthofcelllineandtheeffectwaswithadosedependentmanner.Typicalapoptoticmorphologicfeaturewasdiscoveredunderfluorescencemicroscope.TheapoptoticpeakwasdetectedwithFCMandapoptoticrateincreasedwiththeconcentrationraised.ConclusionsTSAcaninhibittheproliferationandinduceapoptosisinthethyroidcancercellswithadose-dependentmanner.
Keywords:
TSA;thyroidsquamouscellcarcinoma;proliferation;apoptosis
曲古抑菌素A(TrichostatinA,TSA)源自链霉素代谢产物,是一种氧肟酸类非竞争性可逆的组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)抑制剂,也是四大类HDAC抑制剂的代表药物之一。
有研究表明,HDAC抑制剂TSA和丁酸钠均可使人结肠癌细胞系SW1116和人直肠癌细胞系Colo-320的细胞周期阻滞于G1期。
TSA在低于微摩尔浓度时即可通过提高p21waf1的转录阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡,以抑制胰腺癌细胞的生长,TSA还可活化胰腺癌细胞系BxPC-3和MIAPaCa-2中的转化生长因子β受体II(TβRII)。
TSA可在体外抑制人肝癌细胞系HepG2细胞增殖,使Huh-7细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期并诱导凋亡。
另外,人们在对人类膀胱癌细胞T24的研究中发现,HDAC抑制剂SAHA可诱导CDK抑制因子P21/WAF1的转录,从而使癌细胞停止增殖,趋向分化。
已有研究报道TSA对肝癌、胃癌、宫颈癌、前列腺癌及神经母细胞瘤等多种肿瘤细胞具有抗肿瘤作用[1],但对甲状腺癌细胞的影响国内外研究甚少,对甲状腺鳞癌尚无报道。
本研究旨在探讨TSA对甲状腺鳞癌细胞株SW579细胞增殖与凋亡的影响。
1材料与方法
主要试剂与仪器
TSA(SIGMA公司)用二甲基亚砜充分溶解,配成4×10-4mol/L的贮备液,-20℃避光保存。
使用时用细胞培养液稀释到所需浓度。
AnnexinV—FITC凋亡检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司;L15培养液(SIGMA公司产品)按照说明用三蒸水配置,100U/mL青霉素、100μg/mL的链霉素,调整pH值至~,μm微孔滤器无菌过滤,4℃冰箱保存。
使用前加入10%的胎牛血清。
四甲基偶氮唑蓝;倒置显微镜(JAPANOLYMPUSTOKYO)、流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)、荧光显微镜(JAPANOLYMPUSTOKYO)L15培养液;MultiskanAscent自动酶标检测仪。
细胞培养及实验分组
甲状腺鳞癌细胞株SW579购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。
该细胞株在L15培养液中、饱和湿度、37℃、无CO2孵箱中培养。
当细胞汇合至培养瓶底面积80%左右时进行传代培养。
以105/mL浓度接种于25cm2的培养瓶中,24h待细胞贴壁后细胞处于对数生长期时给药,使TSA终浓度分别为25、50、100、200、400nmol/L,加入最大溶解剂量的DMSO为对照组[DMSO浓度小于%(V/V),对细胞生长无影响]。
倒置显微镜下观察细胞形态
在药物处理后48h后取出培养瓶,在倒置显微镜下观察细胞形态学变化,并拍摄记录细胞形态。
MTT法检测细胞生长抑制率
取对数生长期的细胞按1×105/L接种于96孔细胞培养板中,每孔200μL,实验组分别加入不同浓度的TSA20μL(终浓度分别为25、50、100、200、400nmol/L),对照组加入最大溶解剂量的DMSO,每组设8个平行孔。
置于37℃培养箱内培养,作用48h后,每孔加入20μlMTT液(5g/L,以PBS缓冲液配制),继续培养4h后,弃上清,每孔再加入二甲基亚砜(DMSO)150μL,震荡10min,用DG-3033型酶联免疫检测仪测定490nm吸光度(A)值。
用下面的公式计算抑制率。
抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A)×100%。
荧光显微镜下观察细胞凋亡情况
取对数生长期的细胞按1×106/L接种于24孔细胞培养板中,TSA作用48h后,取出培养板,去除培养液,用PBS洗细胞2~3次,95%酒精固定15~20min,倒出酒精后用PBS再洗,加入1%冰醋酸作用30秒,倒出冰醋酸用PBS洗,用%的吖啶橙染色15min,倒出吖啶橙,用PBS洗后置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。
流式细胞仪检测细胞凋亡率
不同浓度组的TSA作用48h后,取出培养瓶,去除培养液,加入2mL消化液消化1min左右,加入5mL培养液,用吸管反复吹打成单细胞悬液,记数后收集细胞于离心管中,1000rmp离心5min,参照试剂盒说明,用4℃预冷的PBS洗细胞2次,将细胞重悬于250μLBindingBuffer,调节其浓度为106/mL,取100μL的细胞悬液于5mL流式管中,加入5μLAnnexinV—FITC和10μL、20μg/mLPI,轻轻混匀,避光室温反应15min,加入400μLPBS后上流式细胞仪检测。
统计学处理
实验所得数据以±s表示,应用SPSS统计软件进行单因素方差分析,P<具有显着性意义,P<具有极显着性意义。
2结果
TSA对细胞形态特征的影响
不同浓度TSA作用于SW579细胞后,与对照组相比,细胞生长速度变慢,在对照组中成多角形及梭形的细胞经TSA处理后可见细胞贴壁延迟、回缩,TSA的浓度越高,回缩越明显;再增加TSA浓度至在800nmol/L时,细胞大部分都回缩成球形,细胞很快死亡,如图1所示。
A对照组BTSA浓度为25nmol/LCTSA浓度为100nmol/LDTSA浓度为400nmol/L图1倒置显微镜下细胞的形态
SW579细胞生长抑制率检测结果
TSA各浓度组细胞生长抑制率见表1。
表1TSA对SW579细胞生长抑制率的影响TSA终浓度表示与对照组相比,P<;#表示与前一组相比,P<
SW579细胞株经不同浓度TSA作用后,各组细胞抑制率随着药物浓度的升高而升高,说明TSA可抑制细胞生长,且呈剂量依赖性。
荧光显微镜下细胞凋亡检测结果
吖啶橙染色后荧光显微镜下观察发现,经TSA处理的各组细胞均可见染色质的浓集和边集,核膜出芽及凋亡小体等现象;TSA浓度越高,染色质的浓集和边集越明显,核膜出芽及凋亡小体越多,如图2所示。
A对照组BTSA浓度为25nmol/LCTSA浓度为100nmol/LDTSA浓度为400nmol/L
图2荧光显微镜下细胞的凋亡细胞凋亡率的检测结果
该细胞株经不同浓度TSA作用后,与对照组相比,各组细胞凋亡率显着升高,并随着TSA浓度的升高而升高,P<,如表2所示。
表2不同浓度TSA作用下的细胞凋亡率Δ表示与对照组相比,P<;#表示与前一组相比,P<
3讨论
近年的研究显示[2],表观遗传修饰调控基因表达主要包括DNA的甲基化和组蛋白乙酰化。
近几年,人们才对组蛋白乙酰化的机理有所理解。
HDAC抑制剂主要是通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构,从而达到调控基因表达的作用,其主要生物效应包括诱导肿瘤细胞分化、细胞周期阻滞和细胞凋亡。
TSA是近年来发现的一种具有抑制肿瘤细胞生长的组蛋白去乙酰化酶抑制剂[3],能抑制多种肿瘤细胞生长,诱导其细胞分化和凋亡,但具体作用机制还尚未完全明确。
MTT是评价细胞增殖的重要指标,本研究中通过MTT、荧光显微镜与流式细胞仪的检测方法从抑制细胞生长增殖与促进凋亡的角度来观察TSA对SW579细胞株的作用情况。
结果显示:
在25~400nmol/L浓度范围内,随着TSA浓度的升高,细胞生长抑制率和凋亡率均明显升高,且呈剂量依赖性,显微镜下观察与对照组相比,细胞生长速度变慢,在对照组中成多角形及梭形的细胞经TSA处理后可见细胞贴壁延迟、回缩,TSA的浓度越高,回缩越明显;荧光显微镜下各组细胞均可见染色质的浓集和边集,核膜出芽及凋亡小体等现象;当TSA浓度达到400nmol/L时,细胞生长抑制率可达%,凋亡率几近50%,在荧光显微镜下也可见明显的凋亡特征,但再提升TSA浓度至800nmol/L时,细胞几近死亡。
本实验结果表明,TSA对SW579细胞株抑制增殖作用可能主要是通过诱导细胞凋亡而起作用的,且最适浓度在25~400nmol/L范围内。
GreenbergVL等研究表明[4]TSA能抑制甲状腺癌细胞株生长、促进其凋亡,阻滞细胞周期于G1和G2/M期,同时增加p21(Cip1/WAF1)及p27Kip1的表达,抑制cyclinsA、B的表达。
其作用是通过激活caspase级联反应,阻滞细胞周期及抑制细胞周期依赖性蛋白激酶活性来实现的。
ZarnegarR等[5]用曲古抑菌素A观察3种甲状腺癌细胞株TPC-1、XTC-1、FTC-133131I的摄取,发现能明显提高NISmRNA的表达,并且同时PDSmRNA转录减少。
增加了放射性碘在肿瘤的滞留,碘摄取增强。
另有研究表明[6],组蛋白去乙酰酶抑制剂亦能在显着增加NISmRNA的表达的同时,增加5’脱碘酶,从而增加甲状腺癌细胞的摄碘,促进甲状腺癌细胞的再分化。
有关TSA对甲状腺鳞癌SW579细胞株生长增殖及细胞凋亡的作用机制还有待于进一步深入研究。
【参考文献】
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