细菌共培养体系合成纳米硒特性.docx
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细菌共培养体系合成纳米硒特性
细菌共培养体系合成纳米硒特性
李严杨婧吴炜泽龚静熙戴春晓曲媛媛**
工业生态与环境工程教育部重点实验室大连理工大学环境学院大连116024
摘要生物合成纳米硒(SeNPs)具有环境友好、安全低毒等特点,备受关注。
目前研究主要集中在纯菌体系,但其存在亚硒酸盐转化率低、耐受性差等问题,因此研究新的纳米硒高效合成体系非常必要。
选取实验室前期筛选得到的两株纳米硒合成细菌Alcaligenessp.YBY和Providenciasp.DCX,分别考察了单菌株及共培养体系(双菌株)对SeO32-的还原能力及其高浓度耐受性。
结果表明,共培养体系还原SeO32-的能力强于单菌株培养且耐受性明显更好,能够在20mmol/LSeO32-浓度下仍然保持33.01%的还原率。
利用表面响应法对共培养体系还原SeO32-合成SeNPs的条件进行了优化,结果表明在2.18mmol/LSeO32-以及pH6.83还原条件下还原率最高,达到了97.09%。
X射线衍射(XRD)分析发现共培养体系合成的SeNPs为六方晶型结构;扫描电镜(SEM)显示形貌主要为球形和伪球形;动态光散射(DLS)结果显示SeNPs平均粒径为18.07nm,分散性良好,分布均匀且具有较好的稳定性。
通过对比单菌株及共培养体系中谷胱甘肽(GSH)含量变化可知,在还原后期共培养体系中GSH分泌量更高,更利于SeO32-还原。
傅里叶变换红外光谱(FTIR)结果显示氨基、羧基等官能团参与了SeO32-还原及稳定过程。
分别对添加及未添加SeO32-的共培养体系进行X射线光电子能谱(XPS)分析,结果表明共培养体系中合成的红色物质为单质纳米硒颗粒,且Se(II)可能是还原过程的中间产物。
上述结果表明共培养体系相较于单菌株培养具有SeO32-还原率高、耐受性好等优势,为生物SeNPs的高效合成及共培养体系的实际应用提供了理论参考。
(图9表3参34)
关键词纳米硒;共培养体系;生物合成;表面响应法;SeO32-还原
Biosyntheticseleniumnanoparticlesbythebacteriaco-culturesystem
LIYan,YANGJing,WUWeize,GONGJingxi,DAIChunxiao,QUYuanyuan**
KeyLaboratoryofIndustrialEcologyandEnvironmentalEngineering(MinistryofEducation),SchoolofEnvironmentalScienceandTechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024,China
AbstractBiosynthesizingseleniumnanoparticles(SeNPs)haveattractedgreatattentionsowingtothecharacteristicsofenvironmentallyfriendlynatureandhighsafety.Therecentresearchesaremostlyfocusedonthesinglebacteriasystemwhichhastheproblemsoflowselenitereductionrateandpoortolerance.Therefore,itisnecessarytostudyanewefficientsystemofSeNPssynthesis.Inthepreviousexperiment,bacteriumAlcaligenessp.YBYandProvidenciasp.DCXwereisolatedandhavebeenprovedtohavetheabilityofbiosynthesizingSeNPs.TheabilityofreducingSeO32-toSeNPsbyeachsinglestrainandco-culturesystemwereinvestigatedinthisstudy.Besides,thetolerancepropertywasalsoexploredunderhighSeO32concentration.Itwasfoundthattheco-culturesystemhadsignificantlystrongerSeO32-reductionandberttertoleranceabilitythanthatofsinglestrain.Itcouldstillmaintainareductionrateof33.01%at20mmol/LSeO32-.TheoptimalconditionsforSeO32-reductionintheco-culturesystemweredeterminedusingresponsesurfacemethodology(RSM).Andtheresultshowedthatthehighestreductionratereached97.09%at2.18mmol/LSeO32-,pH6.83.X-raydiffraction(XRD)resultsindicatedthattheSeNPssynthesizedbytheco-culturesystemhadahexagonalcrystalstructure.Scanningelectronmicroscope(SEM)illustratedthatthemorphologywassphericalandpseudospherical.Theresultsofdynamiclightscattering(DLS)showedthattheaverageparticlesizeofSeNPswas18.07nm,withgooddispersibility,uniformdistributionandgoodstability.Comparedtothechangesofglutathione(GSH)content,itwasfoundthattheGSHofco-culturesystemwashigherthanthatofsinglestrains.Therefore,thereductionofSeO32-couldbepromotedintheco-culturesystem.Theresultsoffouriertransforminfrared(FTIR)spectroscopyshowedthataminogroups,carboxylgroupsandothergroupsparticipatedinthereductionorstabilityprocesses.X-rayphotoelectronspectroscopy(XPS)analysiswasperformedonaco-culturesystemwithorwithoutSeO32-.Theresultsprovedthattheco-culturesystemsynthesizedelementalseleniumandSe(II)couldbeanintermediateproduct.Insummary,theaboveresultsillustratedthattheco-culturesystemhadtheadvantagesofhigherSeO32-reductionrateandbettertolerancecomparedwithbacteriaYBYorDCXalone.AndthisworkprovidedatheoreticalreferencefortheefficientsynthesisofbiologicalSeNPsandthepracticalapplicationoftheco-culturesystem.
KeywordsSeleniumnanoparticles;Co-culturesystem;Biosynthesis;Surfaceresponsemethod;ReductionofSeO32-
硒(Se)是人体和动物不可或缺的微量元素之一,在自然界中广泛存在。
研究表明,硒过量会导致急性中毒反应,而硒缺乏也与许多疾病有关,包括癌症、心脏病、关节疾病、免疫系统以及生殖功能疾病等[1]。
硒的众多形式中,可溶性硒(SeO42-、SeO32-)毒性较大,其安全性和毒性界限非常相近[2],因此不仅要关注硒对人体健康的重要性,同时也要关注水环境中氧化态硒的去除[3-5]。
微生物在硒的转化过程中发挥着至关重要的作用[6]。
研究发现一些微生物能够在好氧或厌氧条件下,将毒性较高的SeO42-和SeO32-还原为低毒的Se0[7],其中对硒具有高耐受性的好氧微生物还原效果更佳[8]。
近年来,生物合成纳米硒(SeNPs)因其环境友好、安全低毒的特点而备受关注,并且在电化学传感及抗癌治疗等领域具有很好的应用前景[9-10]。
Oremland等人研究发现Sulfurospirillumbarnesii、Bacillusselenitireducens和Selenihalanaerobactershriftii均能够将氧化态硒还原为SeNPs[11]。
Lampis等人分离得到一株Bacillusmycoides,可在胞外合成尺寸为50-400nm的球形SeNPs[12]。
目前已报道具有还原SeO32-并合成SeNPs能力的微生物资源主要为细菌[11-12]、真菌[13-14]和放线菌[15-16],其中细菌具有繁殖速度快,可操作性强的优势[17]。
共培养是指在无菌条件下,一些特定的微生物在厌氧或好氧条件下的混合培养[18-19]。
有关微生物还原SeO32-并合成SeNPs的研究目前主要集中在单菌和反应器中,对共培养还原SeO32-并合成SeNPs的研究还鲜有相关报道。
本研究选择实验室前期筛选得到的能够还原SeO32-合成SeNPs的Providenciasp.DCX和Alcaligenessp.YBY,分别探究单菌株及共培养体系还原SeO32-并合成SeNPs的能力,并对共培养合成的生物SeNPs颗粒进行形貌及尺寸表征分析。
通过比对单菌株与共培养体系对SeO32-的还原能力差异及合成SeNPs的特性,对共培养体系合成生物SeNPs进行初步研究,为SeO32-的还原及SeNPs的生物合成提供参考。
1材料与方法
1.1菌株
菌株Providenciasp.DCX和Alcaligenessp.YBY均分离自近海泥沙样品,两者的16SrRNA基因序列均上传于GenBank数据库,保存号分别为MF957299[20]、MF957298[21]。
本实验所用培养基为LB培养基,其组成为:
NaCl10.0g/L,蛋白胨10.0g/L,酵母浸粉5.0g/L,pH为7.0。
配置的培养基经高温蒸汽灭菌(121℃,20min)后使用。
1.2主要试剂
亚硒酸钠(Na2SeO3),分析纯,购自天津市化学试剂研究所;氯化钠(NaCl),分析纯,购自天津市富宇精细化工有限公司;蛋白胨和酵母浸粉,购自北京奥博星生物技术有限责任公司;还原型谷胱甘肽含量试剂盒,购自索莱宝生物科技有限公司;本实验所用其他试剂均为分析纯及以上。
1.3仪器设备
实验使用主要仪器为:
MetashUV-9000双光紫外-可见分光光度计(上海)、FE20-FiveEasypH计(瑞士)、EQUINOX傅立叶红外光谱仪(德国)、K-Alpha+X射线光电子能谱仪(美国)、SmartLab智能X射线衍射仪(日本)、HITACHISU8010扫描电子显微镜(日本)、JY92-IIN超声波细胞破碎仪(宁波)、Malvernnano-ZS90纳米粒度仪(英国)。
1.4单菌株培养及共培养体系还原SeO32-合成SeNPs
在前期预试验中发现不同混合比例下的共培养体系对SeO32-的还原率差别不大,因此仅选择1:
1混合比例的共培养体系考察其特性。
本研究中,在LB培养基中以5%的接种量分别接种单独培养的菌株DCX和YBY作为单菌株体系,以1:
1的菌量比例接种菌株DCX和YBY作为共培养体系。
在单菌株与共培养体系中,均加入终浓度为3mmol/L的Na2SeO3溶液,于150r/min、30℃的条件下培养,每隔2h取样,分别测定pH以及培养基中残留的SeO32-浓度,并绘制变化曲线。
在相同的实验条件下,分别向单菌株与共培养体系中加入终浓度为7.5mmol/L和20mmol/L的Na2SeO3溶液,于150r/min、30℃条件下培养24h后,测定培养基中残留的SeO32-浓度,进而考察单菌株与共培养体系对高浓度SeO32-的耐受能力。
1.5共培养体系还原SeO32-的条件优化
为考察多种因素对共培养体系还原SeO32-合成SeNPs的影响,采用表面响应法中的中心组合设计(CentralCompositeDesign,CCD),对实验参数进行条件优化设计。
中心组合设计是基于最小二乘法的二阶设计方法[22],能够简便地反映不同环境因素之间的交互影响情况。
中心组合设计方法利用二阶多项式回归方程建立基础模型:
Y=β0+β1A+β2B+β11A2+β22B2+β12AB
式中,Y为响应值,A、B为2个独立变量。
由预实验确定的独立变量转化为无量纲代数(A、B)。
常数β0、一次常数βi、二次常数βii、交叉常数βij等则通过实验值确定。
本实验中,SeO32-还原率为响应目标(Y),考察的影响因素包括培养基中的SeO32-浓度(因素A)及pH(因素B)。
选取不同的SeO32-浓度(0.5、1、2、3、5、7mmol/L),利用HCl和NaOH溶液调节培养基的初始pH值(4、5、6、7、8、9、10),考察SeO32-浓度和pH对共培养体系还原SeO32-的影响,并确定实验设计范围。
最后使用软件DesignExpert8.0.6对实验进行设计和数据分析,得到的实验条件见表1。
1.6共培养体系合成SeNPs的表征
X射线衍射仪(XRD):
共培养体系以优化后得到的最佳条件培养24h后,取适量SeNPs溶液,在10000r/min条件下离心10min,弃掉上清液。
得到的SeNPs样品充分干燥后研磨成细碎粉末,并均匀置于载玻片上,采用全自动X-射线衍射仪D/max-2400对样品进行表征,Cu靶Ka辐射,波长λ=0.154056nm,工作电压12KW,精度0.01,2θ扫描区间10°-80°,扫描速度10°/min。
扫描电子显微镜(SEM):
共培养体系以优化后得到的最佳条件培养24h后,取菌液2mL于离心管中,在8000r/min、4℃条件下离心10min,弃掉上清液。
然后加入2.5%(V/V)戊二醛溶液用于固定菌体,在4℃条件下静置2h后,在相同条件下离心10min,弃掉上清。
之后依次用30%、50%、75%、90%和95%(V/V)的乙醇在相同条件下离心、梯度脱水,每次需在4℃条件下静置10min。
结束后再利用100%乙醇脱水1次,最后用100%乙醇保存备用[23]。
检测时将20μL样品滴加在硅片上,等待溶液完全蒸发后喷金并利用扫描电子显微镜对菌株细胞及产物进行观察。
动态光散射(DLS):
共培养体系以优化后得到的最佳条件培养24h后,取适量菌液,在10000r/min条件下离心10min,弃掉上清液。
加入少量去离子水重悬,然后利用超声波细胞破碎仪在4oC条件下破碎菌体30min,再用离心机在3000r/min条件下离心10min,去掉细胞碎片。
加入少量去离子水重悬后用纳米粒度及ζ-电位分析仪进行表征。
1.7共培养体系还原SeO32-的活性物质测定
谷胱甘肽含量变化测定:
分别将菌株DCX、YBY以及两株菌按照1:
1接种于3个LB培养基中,培养基中分别加入终浓度为3mmol/L的Na2SeO3溶液,培养条件为150r/min、30℃。
每隔2h分别从3个培养基中取样2mL,在10000r/min条件下离心10min,取上清液并使用谷胱甘肽试剂盒测定谷胱甘肽含量变化。
傅立叶转换红外线光谱(FTIR):
取适量共培养体系的反应后菌液在10000r/min条件下离心10min,弃掉上清液。
得到的SeNPs样品置于90℃烘箱中充分干燥后研磨,分别与溴化钾混合压片,在室温下用FTIR在400-4000cm-1范围内测量其吸收光谱,扫描速度为5kHz。
以单菌株还原Na2SeO3的体系作为对照。
X射线电子能谱分析(XPS):
共培养体系与Na2SeO3反应结束后,取适量菌液在10000r/min条件下离心10min,弃掉上清液,得到的SeNPs样品置于90℃烘箱中充分干燥后研磨成粉末,将研磨后的粉末用X射线光电子能谱检测其产物元素。
以不加入Na2SeO3的共培养体系作为空白对照。
2结果与讨论
2.1共培养体系与单菌株还原SeO32-能力比较
以3mmol/LSeO32-浓度,pH7.0为初始条件分别培养菌株DCX、YBY及菌株比例为1:
1的共培养体系。
得到如图1(a)(b)所示的pH、SeO32-还原率随时间的变化情况。
pH对微生物细胞膜通透性、胞内酶促反应、胞内物质电离性等均有影响,同时也会显著影响细菌对SeO32-的还原过程,因此首先探讨了单菌株与共培养体系的pH变化。
由图1(a)可知,在培养条件相同的情况下,单菌株及共培养体系pH的变化相似,各实验组中pH均随培养时间增长而增加,最终稳定在8.5-9.0之间。
由于菌株YBY属于产碱杆菌,相比于其他两组pH更高,最多高出0.4。
菌株DCX与YBY共培养使得整个体系的pH在后期略有下降,并保证了体系中pH稳定在8.4左右。
其次考察了单菌和共培养体系对SeO32-还原率的变化。
如图1(b)所示,共培养体系对SeO32-的还原率在培养初期略低于单菌株培养,推测是由于前期两株菌株在共培养的过程中争夺生存资源导致了菌株间的生长竞争和抑制[17]。
后文对于谷胱甘肽含量的测定,在共培养体系初期较低可能同样是菌株间生长竞争的原因,并最终导致共培养体系对SeO32-的还原率在培养初期略低于单菌株培养。
但是8-16h还原率提高到67.43%并超过了单菌株体系,到22h左右达到最大96.43%,且最大还原率明显高于单菌株培养,高于菌株LactobacillusacidophilusLA5还原Na2SeO3的还原率[24]。
该结论说明共培养体系能够提升菌株还原SeO32-的能力。
根据前期实验,SeO32-浓度从5mmol/L增加到7mmol/L,共培养体系还原率从88.27%下降至51.13%,表明SeO32-浓度高于7mmol/L后SeO32-的还原率急剧下降,因此后续实验将7.5mmol/L和20mmol/L作为高浓度条件比较菌株DCX、YBY和共培养体系还原SeO32-能力的差异。
图1(c)中显示了在7.5mmol/L的SeO32-条件下,共培养体系的SeO32-还原率为30.96%,明显高于菌株DCX(还原率25.27%)和YBY(还原率22.27%)。
在20mmol/L的SeO32-条件下,共培养体系的SeO32-还原率仍明显高于菌株DCX和YBY。
结果说明共培养体系可能增强了菌株抵抗SeO32-的能力,使体系对SeO32-的耐受程度明显提升。
(a)(b)
(c)
图1单菌株及共培养体系培养过程中pH变化(a)、SeO32-还原率变化(b)、高浓度SeO32-的耐受性(c).
Fig.1ThechangeofpH(a),thereductionrateofSeO32-(b)andtolerancetohighconcentrationsofSeO32-(c)duringthecultivationofsinglestrainandco-culturesystem.
2.2共培养还原SeO32-的条件优化
pH及SeO32-浓度等因素对共培养体系还原SeO32-的过程有着重要影响。
因此,采用表面响应法考察初始pH、SeO32-浓度等因素对SeO32-还原率的影响,对共培养体系还原SeO32-的条件进行优化。
通过预实验确定优化范围,SeO32-的浓度范围为1-4mmol/L,pH范围为5.0-9.0。
利用DesignExpert8.0.6进行实验设计,得到的设计条件及结果如表1所示。
表1共培养体系合成SeNPs的优化实验设计
Table1Optimalexperimentaldesignofco-culturesystemtosynthesizeSeNPs
SeO32-浓度concentrationofSeO32-(mmol/L)
pH
SeO32-还原率ReductionrateofSeO32-(%)
实测值Observedvalue
预测值Predictivevalue
2.50
9.83
74.77
81.43
2.50
7.00
96.79
96.27
1.00
5.00
85.84
86.17
2.50
7.00
87.67
96.27
0.38
7.00
82.95
88.27
2.50
7.00
96.54
96.27
2.50
7.00
96.72
96.27
2.50
7.00
97.09
96.27
4.00
9.00
79.29
77.69
1.00
9.00
91.80
87.29
4.00
5.00
81.73
84.97
4.62
7.00
79.43
80.64
2.50
4.17
85.97
85.78
利用软件DesignExpert8.0.6对实验数据进行回归分析,得到回归方程:
Y=-1.30681+16.24405A+23.11668B-2.62878A2-1.58119B2-0.7AB
式中,A为SeO32-浓度,B为pH。
利用DesignExpert8.0.6对得到的回归方程进行ANOVA方差分析,结果见表2。
该软件得到两个变量对SeO32-还原率影响的相互作用3D效果图(图2)。
表2模型的ANOVA方差分析
Table2ANOVAofresponsesurfa
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