课件一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能.pptx
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激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscopeLaserScanningConfocalMicroscopeLaserScanningConfocalMicroscopeLaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLSCMLSCMLSCM)-基本原理及实例应用基本原理及实例应用李真李真西西7-1032015-10研究生细胞生物学技术研究生细胞生物学技术一种观察工具,需要前面的实验做基础一种观察工具,需要前面的实验做基础免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染激光激光扫描扫描共聚焦显微镜共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCM什么是什么是LSCMLSCM用来做什么用来做什么?
它和荧光显微镜的关系?
它和荧光显微镜的关系?
它和电子显微镜的关系?
它和电子显微镜的关系?
观察的信号如何而来?
观察的信号如何而来?
激光激光扫描扫描共聚焦显微镜共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCM激光共聚焦显微镜的原理激光共聚焦显微镜的原理第一部分第一部分泛指将微小泛指将微小(分辨率分辨率0.20.2M)M)不可见或难见物不可见或难见物品之影像放大品之影像放大,而能被观察的工具。
而能被观察的工具。
目镜目镜光源光源聚焦旋钮聚焦旋钮光阑和聚光器光阑和聚光器载物台载物台物镜物镜显微镜(显微镜(Microscope)用于研究用于研究荧光荧光或或荧光标记物质荧光标记物质的光学显微镜。
的光学显微镜。
荧光显微镜荧光显微镜FluorescenceMicroscope照相装置照相装置光源(汞灯)光源(汞灯)标记了荧光的样品标记了荧光的样品基本原理基本原理紫外、蓝、绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光分光镜分光镜(长通短反长通短反)物镜物镜共聚焦显微镜成像物镜物镜标本标本针孔(针孔(pinhole)焦平面焦平面普通荧光显微镜成像普通荧光显微镜成像激光激光扫描扫描共聚焦显微镜共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCM-以以激光激光作为激发光源,采用光源针孔与检作为激发光源,采用光源针孔与检测针孔测针孔共轭聚焦共轭聚焦技术,对样本进行技术,对样本进行断层扫描断层扫描,以获得高分辨率光学切片的以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜荧光显微镜系统。
系统。
光源光源光学原理光学原理成像原理成像原理基于的平台基于的平台激光激光针孔的共轭聚焦技术针孔的共轭聚焦技术断层扫描断层扫描荧光显微镜系统荧光显微镜系统荧光显微镜荧光显微镜VSVS激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激发光源激发光源荧光显微镜光源汞灯汞灯卤素灯卤素灯其他普通光源其他普通光源特点激发波长范围广激发波长范围广激光共聚焦显微镜光源激光激光特点光色纯光色纯方向性好方向性好能量可调能量可调荧光显微镜荧光显微镜VSVS激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜光学原理光学原理荧光显微镜荧光显微镜光源针孔光源针孔检测针孔检测针孔激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜分光镜分光镜光源光源检测器检测器标本标本物镜物镜分光镜不在焦平面的发射光发射光位于焦平面的发射光发射光物镜激发光线激光器http:
/VSVS激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜光学原理光学原理共轭聚焦共轭聚焦移动激光扫描器,逐点扫描扫描扫描点光源点光源荧光显微镜系统荧光显微镜系统样品样品荧光显微镜荧光显微镜VSVS激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜成像原理成像原理激光激光扫描扫描共聚焦系统共聚焦系统断层扫描技术,断层扫描技术,逐点逐行扫描成像逐点逐行扫描成像CCD成成像像技技术术,一一次次性性成成像像XX光机光机CTCT机机普通荧光显微镜激光共聚焦显微镜特点:
特点:
侧面有扫描器接口;侧面有扫描器接口;装有微量步进马达;装有微量步进马达;装有防振动装置;装有防振动装置;装有光路转换装置;装有光路转换装置;配高数值孔径的物镜。
配高数值孔径的物镜。
荧光显微镜荧光显微镜VSVS激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜基于的平台基于的平台-显微镜系统显微镜系统特点:
特点:
侧面有扫描器接口;侧面有扫描器接口;装有微量步进马达;装有微量步进马达;装有防振动装置;装有防振动装置;装有光路转换装置;装有光路转换装置;配高数值孔径的物镜。
配高数值孔径的物镜。
激光共聚焦激光共聚焦PMTPMT检测器检测器伪彩色伪彩色灵敏度高灵敏度高光信号光信号-电信号电信号-图像图像由计算机精确控制图像的合成和输出,由计算机精确控制图像的合成和输出,同时电信号增加放大倍数。
同时电信号增加放大倍数。
多通道荧光采集多通道荧光采集一般一般33个荧光通道和一个透射光通道,分个荧光通道和一个透射光通道,分别成像别成像荧光显微镜荧光显微镜VSVS激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜基于的平台基于的平台获取图像方式获取图像方式荧光显微镜荧光显微镜目镜或目镜或CCDCCD真彩色真彩色所见即所得所见即所得单通道荧光采集单通道荧光采集荧光显微镜荧光显微镜VSVS激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜基于的平台基于的平台获取图像方式获取图像方式伪彩色伪彩色-以以激光激光作为激发光源,采用光源针孔与检测针孔作为激发光源,采用光源针孔与检测针孔共轭聚共轭聚焦焦技术,对样本进行技术,对样本进行断层扫描断层扫描,以获得高分辨率光学切片的,以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜荧光显微镜系统。
系统。
激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope,LSCMLaserScanningConfocalMicroscope,LSCM将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的高技术设备。
合在一起的高技术设备。
激光激光/光学显微镜结合,高灵敏度探测器,高性能计算机光学显微镜结合,高灵敏度探测器,高性能计算机/图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。
图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。
激光扫描共聚焦显微镜的优缺点激光扫描共聚焦显微镜的优缺点优势优势高垂直分辨率高垂直分辨率沿沿Z轴逐层扫描,经过计算机处理成为三轴逐层扫描,经过计算机处理成为三维图像。
维图像。
高水平分辨率高水平分辨率人眼分辨率:
人眼分辨率:
0.20mm光学显微镜分辨率:
光学显微镜分辨率:
0.25mmm共焦显微镜分辨率:
共焦显微镜分辨率:
0.18mmm电子显微镜分辨率:
电子显微镜分辨率:
0.20nm局限局限共聚焦显微镜的分辨率理论极限共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是大约是0.15mmm,轴向分辨率,轴向分辨率0.5mmm。
观测厚度(观测厚度(60X):
):
50-100mmm一次只获得某一层面的图像信息一次只获得某一层面的图像信息共聚焦显微镜是逐点成像,成像共聚焦显微镜是逐点成像,成像速度较慢速度较慢1957年,年,MarvinMinsky在他的专利中首次阐明了激光扫在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理描共聚焦显微镜技术的基本工作原理1967年,年,Egger和和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面一个光学横断面1970年,年,Sheppard和和Wilson推出第一台单光束共聚焦激推出第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世光扫描显微镜问世1985年,多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消年,多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊,得到清晰的图像,至此除焦点模糊,得到清晰的图像,至此LSCM技术基本成熟技术基本成熟1987年,年,BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜微镜激光扫描共聚焦显微镜的发展激光扫描共聚焦显微镜的发展目前常见的激光共聚焦显微镜目前常见的激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜构成激光共聚焦显微镜构成扫描器系统荧光显微镜系统计算机图像存储与处理系统ZeissLSM-710ConfocalSystem激光光源ZeissLSM-510ConfocalSystemZeissLSM-710ConfocalSystem激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能第二部分第二部分激光共聚焦显微镜的功能激光共聚焦显微镜的功能ZOOMZOOM成像成像薄层光学切片薄层光学切片荧光定量分析荧光定量分析多维度成像多维度成像多通道同时扫描多通道同时扫描薄层光学切片薄层光学切片激光激光激光激光共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能使用使用共扼光路共扼光路使非焦平面的光线被抑制,使非焦平面的光线被抑制,减少了成像的干扰。
减少了成像的干扰。
使用光色较纯的使用光色较纯的激光激光,所以成像分辨率可,所以成像分辨率可达普通光学显微镜的达普通光学显微镜的1.41.4倍。
倍。
逐点扫描逐点扫描,形成光学切片,形成光学切片牛肺上皮细胞展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节ByGeorgevonDassow,UniversityofOregon展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节展现最清晰成像细节小鼠神经元细胞高清晰成像高清晰成像多通道同时扫描多通道同时扫描普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光,要观测多普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光,要观测多种荧光标记的样品需要多次观测,对样品损伤大。
种荧光标记的样品需要多次观测,对样品损伤大。
激光共聚焦显微镜可以激光共聚焦显微镜可以多激光多通道多激光多通道同时扫描,多同时扫描,多通道同时探测。
通道同时探测。
激光激光激光激光共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能动脉内皮细胞三标记动脉内皮细胞三标记多重荧光标记多重荧光标记海马DG区绿色:
SYBR14染色,活精子红色:
PI染色,死精子绿色:
活菌红色:
死菌牛精子牛精子藤黄微球菌藤黄微球菌拟南芥,ByHeitiPaves,CentreofExcellenceENVIRON,Estonia斑马鱼神经元系统,byAlbertPan,HarvardUniversity共聚焦绚丽图像共聚焦绚丽图像视网膜烟花,byJoshR.Sanes,HarvardUniversityZOOM成像成像激光激光激光激光共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能在不变换镜头的情况下,对某幅图片的局部放大,在不变换镜头的情况下,对某幅图片的局部放大,并进行精细并进行精细逐点扫描逐点扫描成像,获得高分辨率图像。
成像,获得高分辨率图像。
共聚焦的优势共聚焦的优势ZOOMZOOM成像成像ZOOMZOOM和高分辨率扫描的极限和高分辨率扫描的极限尽量使尽量使用高数用高数值孔径值孔径油镜!
油镜!
多维度扫描多维度扫描通过调节针孔的大小,控制样品扫描层面的厚度,通过调节针孔的大小,控制样品扫描层面的厚度,可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。
可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。
并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立体图像。
体图像。
XYZ扫描扫描XYT扫描扫描激光激光激光激光共聚焦显微镜的功能共聚焦显微镜的功能共聚焦显微
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- 课件 激光 聚焦 扫描 显微镜 原理 功能