细胞破碎与分离设备.ppt
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第六章第六章细胞破碎与料液细胞破碎与料液分离设备分离设备细胞破碎就是采用一定的方法,在一定程度上破细胞破碎就是采用一定的方法,在一定程度上破坏坏细胞壁和细胞膜细胞壁和细胞膜,使细胞内容物包括目的产物使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型非分泌型生化物质(产品)的基础。
生化物质(产品)的基础。
细胞破碎定义细胞破碎定义为了研究细胞的破碎,提高其破碎率,有必要了解各种生物为了研究细胞的破碎,提高其破碎率,有必要了解各种生物细胞壁的组成和结构。
细胞壁的组成和结构。
生物类型生物类型G+G+细菌细菌G-G-细菌细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌植物细胞植物细胞主要组成主要组成肽聚糖肽聚糖(40-90%40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%1-4%)肽聚糖肽聚糖(5-10%5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%30%)蛋白质蛋白质(6-8%6-8%)脂类脂类(8.5-8.5-13.5%13.5%)多聚糖(几多聚糖(几丁质)丁质)(80-90%80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质初生壁初生壁次生壁次生壁细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构u细菌细菌破碎的主要阻力来自于破碎的主要阻力来自于肽聚糖肽聚糖的网状结构,网状结的网状结构,网状结构越致密,破碎的难度越大,革兰氏阴性细菌网状结构不构越致密,破碎的难度越大,革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固;及革兰氏阳性细菌的坚固;u酵母酵母葡聚糖葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架,甘露聚的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架,甘露聚糖形成网状结构,细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构糖形成网状结构,细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度;交联的紧密程度和它的厚度;u霉菌霉菌细胞壁中含有细胞壁中含有几丁质或纤维素几丁质或纤维素的纤维状结构,其强的纤维状结构,其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高;度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高;u植物细胞植物细胞次生壁次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性,使植物的形成提高了细胞壁的坚硬性,使植物细胞具有很高的机械强度。
细胞具有很高的机械强度。
常用破碎方法常用破碎方法分分类类作作用用机机理理适适应应性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率,可较大规模操作,可达较高破碎率,可较大规模操作,大分子目的产物易失活,浆液分离困大分子目的产物易失活,浆液分离困难难高压匀浆高压匀浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率,可大规模操作,不可达较高破碎率,可大规模操作,不适合丝状菌和革兰氏阳性菌适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎超声破碎法法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差,破碎过程升温剧对酵母菌效果较差,破碎过程升温剧烈,不适合大规模操作烈,不适合大规模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高,活性保留率高,对冷冻敏破碎率高,活性保留率高,对冷冻敏感目的产物不适合感目的产物不适合非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性,条件温和,浆液易具有高度专一性,条件温和,浆液易分离,溶酶价格高,通用性差分离,溶酶价格高,通用性差化学渗透化学渗透法法改变细胞膜的渗透改变细胞膜的渗透性性具一定选择性,浆液易分离,但释放具一定选择性,浆液易分离,但释放率较低,通用性差率较低,通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低,常与其他方法结合使用破碎率较低,常与其他方法结合使用冻结融化冻结融化法法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低,不适合对冷冻敏感目的破碎率较低,不适合对冷冻敏感目的产物产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈,易引起大分子物质失条件变化剧烈,易引起大分子物质失活活机械法进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂(直径小于砂、氧化铝等研磨剂(直径小于1mm1mm)一起快速搅)一起快速搅拌或研磨,研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、拌或研磨,研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞,使细胞破碎,释放出内含物。
在珠液分离器碰撞,使细胞破碎,释放出内含物。
在珠液分离器的协助下,珠子被滞留在破碎室内,浆液流出从而的协助下,珠子被滞留在破碎室内,浆液流出从而实现连续操作。
破碎中产生的热量一般采用夹套冷实现连续操作。
破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。
却的方式带走。
1.1.珠磨法(珠磨法(BeadmillBeadmill)原理:
原理:
n实验室规模的细胞破碎设备有实验室规模的细胞破碎设备有MickleMickle高速组织捣碎机、高速组织捣碎机、BraunBraun匀浆器;匀浆器;n中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理;中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理;n在工业规模中,可采用高速珠磨机(瑞士在工业规模中,可采用高速珠磨机(瑞士WABWAB公司和德国公司和德国西门子机械公司制造)。
西门子机械公司制造)。
u珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%80%以下。
以下。
u珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。
珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。
胶体磨胶体磨德国进口珠磨机德国进口珠磨机2.2.高压匀浆法(高压匀浆法(High-pressurehomogenizationHigh-pressurehomogenization)利用高压使细胞悬浮液通过针形阀,由于突然减压和高速冲利用高压使细胞悬浮液通过针形阀,由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时,击撞击环使细胞破碎,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时,每秒速度高达几百米,高速喷出的浆液又射到静止的撞击环每秒速度高达几百米,高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上,被迫改变方向从出口管流出。
细胞在这一系列上,被迫改变方向从出口管流出。
细胞在这一系列高速高速运动运动过程中经历了剪切、碰撞及由过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压高压到常压的变化,从而造成的变化,从而造成细胞破碎。
细胞破碎。
原理:
原理:
大规模细胞破碎的常用方法,在微生物细胞和植物大规模细胞破碎的常用方法,在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用细胞的大规模处理中常采用高压匀浆器的排出阀p易造成堵塞的团状或丝状真菌易造成堵塞的团状或丝状真菌p较小的革兰氏阳性菌较小的革兰氏阳性菌p含有包含体的基因工程菌含有包含体的基因工程菌不宜采用高压匀浆法的细胞类型。
不宜采用高压匀浆法的细胞类型。
u影响匀浆破碎的主要因素:
影响匀浆破碎的主要因素:
影响匀浆破碎的主要因素:
影响匀浆破碎的主要因素:
u压力、温度、通过匀浆器阀的次数压力、温度、通过匀浆器阀的次数压力、温度、通过匀浆器阀的次数压力、温度、通过匀浆器阀的次数大、中、小型高压匀浆器大、中、小型高压匀浆器利用发射利用发射15-25kHz15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。
的超声波探头处理细胞悬浮液。
一般认为超声波破碎的机理是:
在超声波作用下液一般认为超声波破碎的机理是:
在超声波作用下液体发生空化作用,空穴的形成、增大和闭合产生极体发生空化作用,空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,使细胞破碎。
大的冲击波和剪切力,使细胞破碎。
3.3.超声破碎法(超声破碎法(UltrasonicationUltrasonication)影响超声波的细胞破碎效率因素:
频率、液体温影响超声波的细胞破碎效率因素:
频率、液体温度和粘度、处理时间等。
度和粘度、处理时间等。
超声波破碎法是很强烈的破碎方法,适用于多数超声波破碎法是很强烈的破碎方法,适用于多数微生物的破碎。
微生物的破碎。
一般杆菌比球菌易破碎,一般杆菌比球菌易破碎,G-G-细菌细菌比比G+G+细菌易破碎,对酵母菌的效果较差。
细菌易破碎,对酵母菌的效果较差。
该法在实验室小规模细胞破碎中常用。
该法在实验室小规模细胞破碎中常用。
非机械法1.1.酶溶法(酶溶法(EnzymaticEnzymaticLysisLysis)(11)外加酶法)外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶溶菌酶-1-1,3-3-葡聚糖酶葡聚糖酶-1-1,6-6-葡聚糖酶葡聚糖酶蛋白酶蛋白酶甘露糖酶甘露糖酶糖苷酶糖苷酶肽键内切酶肽键内切酶壳多糖酶等壳多糖酶等u利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受到部分或完全破坏后,再利用渗透压冲击等方法到部分或完全破坏后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜,进一步增大胞内产物的通透性。
破坏细胞膜,进一步增大胞内产物的通透性。
u利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶,并确定相应的次序。
和化学组成选择适当的酶,并确定相应的次序。
u酶溶法的优点:
酶溶法的优点:
选择性释放产物,条件温和,核酸泄出量少,细胞外选择性释放产物,条件温和,核酸泄出量少,细胞外形完整。
形完整。
u酶溶法的缺点:
酶溶法的缺点:
溶酶价格高,溶酶法通用性差,产物抑制的存在。
溶酶价格高,溶酶法通用性差,产物抑制的存在。
u诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力,以达到细胞自溶的目的。
酶的活力,以达到细胞自溶的目的。
u影响自溶过程的主要因素有温度、时间、影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pHpH值、值、激活剂和细胞代谢途径等。
激活剂和细胞代谢途径等。
u缺点:
对不稳定的微生物,易引起所需蛋白质缺点:
对不稳定的微生物,易引起所需蛋白质的变性,自溶后细胞悬浮液粘度增大,过滤速度的变性,自溶后细胞悬浮液粘度增大,过滤速度下降。
下降。
(22)自溶法()自溶法(AutolysisAutolysis)某些化学试剂,如有机溶剂、变性剂、表面活性某些化学试剂,如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等,可以改变细胞壁或剂、抗生素、金属螯合剂等,可以改变细胞壁或膜的通透性(渗透性),从而使胞内物质有选择膜的通透性(渗透性),从而使胞内物质有选择地渗透出来。
地渗透出来。
2.2.化学渗透法(化学渗透法(ChemicalpermeationChemicalpermeation)TritonX-100TritonX-100牛黄胆酸钠牛黄胆酸钠十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠(11)表面活性剂)表面活性剂表面活性剂可促使细胞某些组分溶解,其表面活性剂可促使细胞某些组分溶解,其增溶作增溶作用用有助于细胞的破碎。
有助于细胞的破碎。
u主要是处理主要是处理G-G-细菌细菌,对细胞外层膜有破坏作用。
,对细胞外层膜有破坏作用。
EDTAEDTA将将CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合,大量的脂多糖分子将脱落,使细胞壁螯合,大量的脂多糖分子将脱落,使细胞壁外层膜出现洞穴。
这些区域由内层膜的磷脂来填补,从而导外层膜出现洞穴。
这些区域由内层膜的磷脂来填补,从而导致内层膜通透性的增强。
致内层膜通透性的增强。
(22)EDTAEDTA螯合剂螯合剂u能分解细胞壁中的类脂,使胞壁膜溶胀,细胞破裂,能分解细胞壁中的类脂,使胞壁膜溶胀,细胞破裂,胞内物质被释放出来。
胞内物质被释放出来。
乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
(33)有机溶剂)有机溶剂u与水中氢键作用,削弱溶质分子间的疏水作用,从而使疏与水中氢键作用,削弱溶质分子间的疏水作用,从而使疏水性化合物溶于水溶液。
水性化合物溶于水溶液。
盐酸胍和脲盐酸胍和脲是常用的变性剂。
是常用的变性剂。
u通用性差;通用性差;u时间长,效率低;时间长,效率低;u有些化学试剂有毒有些化学试剂有毒。
化学渗透法优点:
化学渗透法优点:
缺点:
缺点:
l对产物释放有一定的选择性,可使一些较小分子量的溶对产物释放有一定的选择性,可使一些较小分子量的溶质如多肽和
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