MILLIPORE凋亡试剂盒操作流程.docx
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MILLIPORE凋亡试剂盒操作流程.docx
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MILLIPORE凋亡试剂盒操作流程
自己翻译的,如有出错,请多指教
该试剂盒的优点在于可以迅速得到结果,操作简单,并
且结果清晰,资金允许的话强烈推荐〜
需要准备的试剂
1蛋白酶K(20卩g/m石蜡切片适用
2.正丁醇
3.酒精:
乙酸2:
1
4.1%多聚甲醛-PBS(无甲醇甲醛固定的冰冻切片或细胞)。
5.10(V:
V)中性福尔马林(石蜡包埋固定前)
6.PBS(50mM磷酸钠,PH7.4200mMNACL)
7.30%过氧化氢
8.TritonX-10010%
9.柠檬酸缓冲液(PH=6)294g+100mlH2O
C6H5NA3O7.2H2O
10.PBS(PH=7.4)NA2HPO455g
NAH2PO413.5g
NACL117g
H2O1L
试剂的准备与安装下面推荐的试剂量,足够充分覆盖组织
浓缩的TDT酶在平衡缓冲液中保留其活性。
在使用前
应必须与反应缓冲稀释后才能使用。
混合试剂中70%反应液30%的TDT酶。
在准备时用新的微离心管。
Vol/5cm2
Reagent
EquilibrationBuffer平衡缓冲液
13^L
65^L
WorkingStrengthTdT工作强度转移酶
11yL
55yL
Anti-Digoxigenin-Peroxidase过氧化物酶
13yL
65yL
DABPeroxidaseSubstrateDAE过氧化物底物
15yL
75yL
77yL33yL
110yL
ReactionBuffer(90417)TdTEnzyme(90418)反应液
TDT酶
Total
用漩涡式振荡,该试剂在冰上存放时间不超过6H,这能
足够对付5CM2个标本196
蛋白消化酶或蛋白酶K
200g/mL蛋白酶K在20卩g/m稀释。
在200®/mL的蛋白酶K3.9ML到35MLPBS以给予足够稀释的量。
直接加样,
将30%的双氧水用PBS稀释为3%浓度。
可以在
30MLPBS中加入4ML30%的H2O2。
也可以用10卩L30%氧水加入9011LPBS5CM2需要月60iL.
工作液冲洗液
准备工作液或冲洗液
这些量足够5张片子,这些试剂可以提前准备并储存在
玻璃或塑料容器中,4°C可储存1年。
每次使用时等分工作强度过氧化酶底物按照制造商的指导准备0.05%DAB(0.05MTris或磷酸盐缓冲液,pH7.6),储存在安全的环境下。
细胞核亮绿染色
0.5%亮绿放在0.1M醋酸钠中,PH为4.0(使用乙酸调节PH值)。
在制作过程中不要让标本干糙
1.脱蜡
二甲苯5minX3——100%酒精5minX2——95%酒
精5min70%3minPBS5min
2预处理组织新鲜稀释蛋白裂解酶或蛋白酶K(20卩g/mL)15min
双蒸水2minX2
3内源性过氧化物酶淬灭
3%双氧水(PBS稀释)5min可用染色缸10ulH2O2+90ulPBS)
PBS或蒸馏水冲洗5minX2
4加入平衡缓冲液轻轻拍打多余液体,擦去组织周围多余液体
立刻加入平衡缓冲液(75卩L/5cm290416室温至少孵育10S(也可用去离子水冲洗,直接加TDT
酶)
5加入工作TdT酶轻轻拍打多余液体,擦去组织周围多余液体立刻用移液管加入组织工作强度TdTB(55卩L/5cm2)孵育37%1H
77ul反应液+33ulTdT酶(9041790418)振荡混匀,即用即配,最多放臵不可超过6小时
6.加入停止/洗涤缓冲液
1ml终止液+34ML蒸馏水(90416)将标本放在终止液的染色缸中,振荡15S,室温孵育10分钟从管形瓶中移去大部分抗地高辛共厄物以便足够的标本的量,温暖到室温
7.加入抗地高辛共厄物PBS1minX3
轻轻拍打多余液体,擦去组织周围多余液体加入室温的抗地高辛共厄物(65UL/5CM2)90421室温孵育30min
8.PBS冲中洗
PBS2minX4室温冲洗
中洗是准备DAB
9.DAB显色轻轻拍打多余液体,擦去组织周围多余液体加入足够的过氧化物酶底物完全覆盖标本(75UL.5CM2)室温染色3-6分钟,无需_湿盒为了确定最近染色时间,在显微镜下观察颜色
10.冲洗标本答:
蒸馏水1minX3,长时间冲洗会使显色变淡。
在染色缸内用蒸馏水孵育5min
11.复染标本用0.5%亮绿复染标本10min用染色缸dH2O10minX3,前2次洗之前浸10次,之后振荡30S,第三次冲洗不需振荡。
100%正丁醇10minX3,前2次洗之前浸10次,之后振荡30S,第三次冲洗不需振荡。
12.封片
13.显微镜观察过氧化物酶染色组织冰冻切片或细胞我们建议以下部分予以之前开始这一过程:
技术说明#4:
甲基绿色技术说明#5:
双标记方法技术说明#8:
塑料盖玻片技术说明#9:
控制技术说明#10:
其他预处理技术说明#11:
样品处理技术说明#12:
二甲苯科技注13:
可选的停车点注意:
贴壁细胞培养物可导致酶底物脱离?
,上清液应该检测,如果可以,做细胞离心涂片器细胞凋亡支队从基质中,上清液应进行检验,如果可能
的话使用cytospin处理。
见方法用于I.B.
1.根据样品类型固定标本冰冻切片或组织培养的细胞贴壁
a1%多聚甲醛-PBS(pH值7.4)最好在染色缸固定
10min或者在4°C15h._去除多余液体
bPBS5minX2
c酒精:
乙酸2:
1染色缸5min-20°C,倒出液体,但不要是组织干(这可溶解细胞通透?
)
dPBS5minX2然后进行步骤2
细胞悬液
a在大约5x106cells/mL的密度下固定细胞1%多聚甲醛在PBS(PH=7.4),10min
b干燥50-100UL细胞悬液在病理玻片上(可用细胞离心涂片)
c由于原代细胞可能比培养细胞不易通透,推荐使用酒精:
乙酸前处理?
?
dPBS5minX2,之后进行第二步
2.内源性过氧化物酶的淬灭
注:
这一步对于单细胞是可选的。
如果没有内源性过氧化物酶作用10分钟不见染色(见下文第8节),请跳到步骤3。
a在3.0%h2o2FBS室温5min。
(无论是在片子上或在染色缸)。
bPBS或蒸馏水5minX2用染色缸
3加入平衡缓冲液
轻轻拍打多余液体,擦去组织周围多余液体立刻加入平衡缓冲液(75卩L/5cm2室温至少孵育10S(最佳停止点)
4加入工作TdT酶
轻轻拍打多余液体,擦去组织周围多余液体
立刻用移液管加入组织工作强度TdTB(55卩L/5cm2)孵育37%1H
5.加入停止/洗涤缓冲液将标本放在有工作缓冲液的染色缸中,振荡15S,室温孵育10分钟从管形瓶中移去大部分抗地高辛共厄物以便足够的标本的量,温暖到室温
6.加入抗地高辛共厄物
PBS1minX3轻轻拍打多余液体,擦去组织周围多余液体加入室温的抗地高辛共厄物(65UL/5CM2)室温孵育30min
7.PBS冲中洗
PBS2minX4室温冲洗
中洗是准备过氧化物酶底物
8.在过氧化物酶底物增色
轻轻拍打多余液体,擦去组织周围多余液体加入足够的过氧化物酶底物完全覆盖标本
(75UL.5CM2)
室温染色3-6分钟,无需_湿盒为了确定最近染色时间,在显微镜下观察颜色
9.冲洗标本
蒸馏水1minX3,长时间冲洗会使显色变淡在染色缸内用蒸馏水孵育5min10.复染标本
用0.5%亮绿复染标本10min
14
用染色缸dH2O10minX3,前2次洗之前浸10次,之后振荡30S?
?
?
第三次冲洗不需振荡。
100%正丁醇10minX3,前2次洗之前浸10次,之后振荡30S?
?
?
?
第三次冲洗不需振荡。
12.封片
13.显微镜观察
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