重组人表皮生长因子滴眼液酵母.docx

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重组人表皮生长因子滴眼液酵母

重组人表皮生长因子滴眼液（酵母）

RecombinantHumanEpidermalGrowthFactorEyeDrops（Yeast）

本品系由高效表达人表皮生长因子基因的酵母，经发酵、分离和高度纯化后制成的滴眼液。

含适宜稳定剂。

1基本要求

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2制造

2.1工程菌菌种

2.1.1名称及来源

重组人表皮生长因子工程菌株系由带有人工合成人表皮生长因子基因的重组质粒转化的酵母菌菌株。

2.1.2种子批的建立

应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。

2.1.3菌种检定

主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。

2.1.3.1划种BMG1琼脂平板

应呈典型酵母菌菌落形态，无其他杂菌生长。

2.1.3.2染色镜检

在光学显微镜下观察，应形状规则，用次甲兰染色，无死亡细胞。

2.1.3.3筛选标志检查

应符合该基因表型特征。

2.1.3.4人表皮生长因子表达量

在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。

2.1.3.5人表皮生长因子基因稳定性检查

涂BMG1琼脂平板，挑选至少50个克隆，用聚合酶链反应检测人表皮生长因子基因，阳性率应不低于95％。

2.2原液

2.2.1种子液制备

将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基中培养，供发酵罐接种用。

2.2.2发酵用培养基

采用适宜的不含任何抗生素的培养基。

2.2.3种子液接种及发酵培养

2.2.3.1在灭菌培养基中接种适宜种子液。

2.2.3.2在适宜温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、PH值、溶氧、补料、发酵时间等。

2.2.4发酵液处理

用适宜的方法收集处理菌体。

2.2.5纯化

采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，即为人表皮生长因子原液。

加入稳定剂，除菌过滤后于适宜温度保存，并规定其有效期。

2.2.6原液检定

按3.1项进行。

2.3半成品

2.3.1配制与除菌

2.3.1.1稀释液配制

按经批准的配方配制稀释液。

配制后应立即用于稀释。

2.3.1.2稀释与除菌

将检定合格的人表皮生长因子原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。

除菌过滤后即为半成品，保存与2～8℃。

2.3.2半成品检定

按3.2项进行。

2.4成品

2.4.1分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

2.4.2分装

应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。

2.4.3规格

应为经批准的规格。

2.4.4包装

应符合“生物制品包装规程”规定。

3检定

3.1原液检定

3.1.1生物学活性

依法测定（附录ⅩH）。

3.1.2蛋白质含量

依法测定，（附录ⅥB第二法）。

3.1.3比活性

为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于5.0×105IU。

3.1.4纯度

3.1.4.1电泳法

依法测定（附录ⅣC）。

用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为15.0％，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。

经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0％。

3.1.4.2高效液相色谱法

依法测定（附录ⅢB）。

色谱柱采用丁基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：

取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、以B相（三氟乙酸-乙腈溶液：

取0.5ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（22～37%B相），上样量不低于5μg，于波长220nm处检测，以人表皮生长因子色谱峰计算理论板数应不低于500。

按面积归一化法计算，人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0％。

3.1.5分子量

依法测定（附录ⅣC）。

用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为15.0％，加样量应不低于1.0μg，分子质量应为5.9kD+0.59kD。

3.1.6外源性DNA残留量

每1次人用剂量应不高于10ng（附录ⅨB）

3.1.7宿主菌蛋白残留量

应不高于总蛋白质的0.1%（附录ⅨE）。

3.1.8甲醇含量

甲醇含量应不高于0.002％（附录ⅢC）。

3.1.9等电点

主区带应为4.0～5.0（附录ⅣD）。

3.1.10紫外光谱扫描

最大吸收峰波长应为277±3nm（附录ⅡA）。

3.1.11肽图（至少每半年测定一次）

依法测定（附录ⅧE）,应与对照品图形一致。

3.1.12N-末端氨基酸序列（至少每年测定1次）

用氨基酸序列分析仪测定，其N-末端序列应为：

Asn—Ser—Asp—Ser—Glu—Cys—Pro—Leu—Ser—His—Asp—Gly—Tyr—Cys—Leu。

3.1.13鉴别试验

按免疫印迹法（附录ⅧA）或免疫斑点法（附录ⅧB）测定，应为阳性。

3.2半成品检定

无菌检查

依法检查（附录ⅫA），应符合规定。

3.3成品检定

3.3.1鉴别试验

按免疫印迹法测定（附录ⅧA）或免疫斑点法（附录ⅧB），应为阳性。

3.3.2物理检查

3.3.2.1外观

应为无色澄清液。

3.3.2.2可见异物

依法检查（附录ⅤB），应符合规定。

3.3.2.3装量

依法检查（附录ⅤF），应符合规定。

3.3.3渗透压摩尔浓度

依法测定（附录ⅤH），应为260-320mOsmol.kg-1。

3.3.4pH值

应为6.9～7.3，（附录ⅤA）。

3.3.5生物学活性

应为标示量的70%～200%，（附录ⅩH）。

3.3.5无菌检查

依法检查（附录ⅫA），应符合规定。

4保存、运输及有效期

于2～8℃避光处保存和运输。

自分装之日起，按批准的有效期执行。

5使用说明

应符合“生物制品包装规程”的规定。

重组人干扰素α2b滴眼液

RecombinantHumanInterferonα2bEyeDrops

本品系由含有高效表达人干扰素2b基因的大肠杆菌，经发酵、分离和纯化后制成的滴眼液。

含适宜稳定剂。

1．基本要求

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2．制造

2.1工程菌菌种

2.1.1名称及来源

重组人干扰素2b工程菌株系由人干扰素2b基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。

2.1.2种子批的建立

应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。

2.1.3菌种检定

主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。

2.1.3.1划种LB琼脂平板

应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。

2.1.3.2染色镜检

应为典型的革兰阴性杆菌。

2.1.3.3对抗生素的抗性

应与原始菌种相符。

2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免做）

应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

2.1.3.5生化反应

应符合大肠杆菌生物学性状。

2.1.3.6干扰素表达量

在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。

2.1.3.7表达的干扰素型别

应用抗2b型干扰素参考血清做中和试验，证明型别无误。

2.1.3.8质粒检查

该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。

2.2原液

2.2.1种子液制备

将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。

2.2.2发酵用培养基

采用适宜的不含任何抗生素的培养基。

2.2.3种子液接种及发酵培养

2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。

2.2.3.2在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。

发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录ⅨG）。

2.2.4发酵液处理

用适宜的方法收集处理菌体。

2.2.5初步纯化

2.2.5.1采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。

2.2.6高度纯化

经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，即为人干扰素2b原液。

加入适宜稳定剂，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。

2.2.7原液检定

按3.1项进行。

2．3半成品

2.3.1配制与除菌

2.3.1.1稀释液配制

按经批准的配方配制稀释液。

配制后应立即用于稀释。

2.3.1.2稀释与除菌

将检定合格加稳定剂的人干扰素2b原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。

除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃。

2．3．2半成品检定

按3．2项进行。

2．4成品

2．4．1分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

2．4．2分装

应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。

2.4.3规格

应为经批准的规格。

2．4．4包装

应符合“生物制品包装规程”规定。

3．检定

3.1原液检定

3.1.1生物学活性

依法测定（附录ⅩC）。

3.1.2蛋白质含量

依法测定，（附录ⅥB第二法）。

3.1.3比活性

为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×108IU。

3.1.4纯度

3.1.4.1电泳法

依法测定（附录ⅣC），用非还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。

经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。

3.1.4.2高效液相色谱法

依法测定（附录ⅢB）。

色谱柱以适合分离分子质量为5-60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐—0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量不低于20μg，用波长280nm检测。

以干扰素色谱峰计算理论板数应不低于1000；按面积归一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。

3.1.5分子量

依法测定（附录ⅣC），用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0g，制品的分子质量应为19.2kD±1.92kD。

3.1.6外源性DNA残留量

每一次人用剂量外源性DNA应不高于10ng（附录ⅨB）。

3.1.7鼠源IgG残留量

每一次人用剂量鼠IgG残留量应不高于100ng（附录ⅨL）。

3.1.8宿主菌蛋白残留量

应不高于总蛋白质的0.10%（附录ⅨC）。

3.1.9残余抗生素活性

依法测定（附录ⅨA），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。

3.1.10等电点

主区带应为4.0～6.7（附录ⅣD）。

3.1.11紫外光谱扫描

最大吸收峰波长应为278±3nm（附录ⅡA）。

3.1.12肽图（至少每半年测定1次）

依法测定（附录ⅧE），应与对照品图形一致。

3.1.13N-末端氨基酸序列（至少每年测定1次）

用氨基酸序列分析仪测定，N-末端序列应为：

Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。

3.2半成品检定

3.2.1生物学活性

应为标示量的80%～150%（附录ⅩC）。

3.2.2无菌检查

依法测定（附录ⅫA），应符合规定。

3.3成品检定

3.3.1鉴别试验

按免疫印迹法（附录ⅧA）或免疫斑点法（附录ⅧB）测定，应为阳性。

3.3.2物理检查

3.3.2.1外观

本品为无色或微黄色澄明液体。

3.3.2.2可见异物

依法测定（附录ⅤB），应符合规定。

3.2.2.3装量

依法检查（附录ⅤF），应符合规定。

3.3.3渗透压摩尔浓度

依法测定（附录ⅤH），应为260-320mOsmol.kg-1。

3.3.4pH值

应为6.5～7.5（附录ⅤA）。

3.3.5生物学活性

应为标示量的80%～150%（附录ⅩC）。

3.3.6无菌检查

依法测定（附录ⅫA），应符合规定。

4．保存、运输及有效期

于2—8℃避光处保存和运输。

自分装之日起，按批准的有效期执行。

5．使用说明

应符合“生物制品包装规程”规定。

重组人干扰素2b栓

RecombinantHumanInterferon2bVaginalSuppository

本品系由含有高效表达人干扰素2b基因的大肠杆菌，经发酵、分离和纯化后加入栓剂基质中，经成型、挂膜制备而成。

1．基本要求

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2．制造

2.1工程菌菌种

2.1.1名称及来源

重组人干扰素2b工程菌株系由人干扰素2b基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。

2.1.2种子批的建立

应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。

2.1.3菌种检定

种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。

2.1.3.1划种LB琼脂平板

应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。

2.1.3.2染色镜检

应为典型的革兰氏阴性杆菌。

2.1.3.3对抗生素的抗性

应与原始菌种相符。

2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免做）

应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒或其他微生物污染。

2.1.3.5生化反应

应符合大肠杆菌生物学性状。

2.1.3.6干扰素表达量

在摇床中培养。

2.1.3.7表达的干扰素型别

应用抗2b型干扰素参考血清作中和试验，证明型别无误。

2.1.3.8质粒检查

该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。

2.2原液

2.2.1种子液制备

将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。

2.2.2发酵用培养基

采用适宜的不含任何抗生素的培养基。

2.2.3种子液接种及发酵培养

2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。

2.2.3.2在适宜温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。

发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录ⅨG）。

2.2.4发酵液处理

用适宜的方法收集处理菌体。

2.2.5初步纯化

采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。

2.2.6高度纯化

经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，即为人干扰素2b原液。

加入适宜稳定剂，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。

2.2.7原液检定

按3.1项进行。

2.3栓剂制备

2.3.1配制及灭菌

应按经批准的配方进行。

所用的基质应对腔道无刺激性，能融化、软化或溶化，并与分泌液混合，逐渐释放出干扰素，产生局部作用或全身作用。

2.3.2干扰素加入基质时温度不得超过56℃，应混合均匀。

2.3.3栓剂成型

按批准的生产工艺进行。

栓剂外形应完整光滑，并应有适宜的硬度，以免在包装或贮藏时变形。

2.4成品

2.4.1分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

2.4.2规格

应为经批准的规格。

2.4.3包装

应符合“生物制品包装规程”规定。

3检定

3.1原液检定

3.1.1生物学活性

依法测定（附录ⅩC）。

3.1.2蛋白质含量

依法测定，（附录ⅥB第二法）。

3.1.3比活性

为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×108IU。

3.1.4纯度

3.1.4.1电泳法

依法测定（附录ⅣC），用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马氏亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。

经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。

3.1.4.2高效液相色谱法

依法测定（附录ⅢB），色谱柱以适合分离分子质量为5-60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐—0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量不低于20μg，波长280nm检测，以干扰素色谱峰计算理论板数应不低于1000；按面积归一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。

3.1.5分子量

依法测定（附录ⅣC）。

用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0g，制品的分子质量应为19.2kD±1.92kD。

3.1.6外源性DNA残留量

每1μg蛋白质含外源性DNA应不高于10ng（附录ⅨB）。

3.1.7鼠IgG残留量

每1μg蛋白质含IgG残留量应不高于100ng（附录ⅨL）。

3.1.8宿主菌蛋白残留量

应不高于总蛋白质的0.10%（附录ⅨC）。

3.1.9残余抗生素活性

依法测定（附录ⅨA），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。

3.1.10等电点

主区带应为4.0～6.7（附录ⅣD）。

3.1.11紫外光谱扫描

最大吸收峰波长应为278±3nm（附录ⅡA）。

3.1.12肽图（至少每半年测定1次）

依法测定（附录ⅧE），应与对照品图形一致。

3.1.13N-末端氨基酸序列（至少每年测定1次）

用氨基酸序列分析仪测定，N-末端序列应为：

Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。

3.2成品检定

3.2.1鉴别试验

按免疫印迹法（附录ⅧA）或免疫斑点法（附录ⅧB）测定，应为阳性。

3.2.2物理检查

3.2.2.1外观

应为乳白色或淡黄色栓，外形应完整、均匀、光滑，质硬。

3.2.2.2重量差异

按附录ⅠB中重量差异项进行，应符合规定。

3.2.2.3融变时限

依法检查（附录ⅤD），应符合规定。

3.2.3pH值

应为6.5～7.5（附录ⅤA）。

3.2.4生物学活性

除另有规定外，用测定培养基充分溶解供试品后依法测定（附录ⅩC），应为标示量的80%～150%。

3.2.5微生物限度检查

依法检查（附录ⅫG），应符合规定。

4保存、运输及有效期

于2～8℃避光处保存和运输，自栓剂成型之日起，按批准的有效期执行。

5使用说明

应符合“生物制品包装规程”规定。

注射用重组人白介素-2（I）

RecombinantHumanInterleukin-2（I）forInjection

本品系由含有高效表达人白细胞介素-2（I）[简称人白介素-2（I）]基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后冻干制成。

含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。

1基本要求

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的要求。

2制造

2.1工程菌菌种

2.1.1名称及来源

重组人白介素-2（I）工程菌株系由带有人白介素-2（125Ser）基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株，其中人IL-2基因序列中原125位编码半胱氨酸的序列被突变为编码丝氨酸的序列。

2.1.2种子批的建立

应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。

2.1.3菌种检定

主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。

2.1.3.1划种LB琼脂平板

应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。

2.1.3.2染色镜检

应为典型的革兰阴性杆菌。

2.1.3.3对抗生素的抗性

应与原始菌种相符。

2.1.3.4电镜检查（工作种子批可免做）

应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

2.1.3.5生化反应

应符合大肠杆菌生物学性状。

2.1.3.6人白介素-2表达量

在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。

2.1.3.7质粒检查

该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。

2.2原液

2.2.1种子液制备

将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。

2.2.2发酵用培养基

采用适宜的不含任何抗生素的培养基。

2.2.3种子液接种及发酵培养

2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。

2.2.3.2在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。

发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录ⅪG）

2.2.4发酵液处理

用适宜的方法收集处理菌体。

2.2.5初步纯化

采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。

2.2.6高度纯化

经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，即为人白介素-2（I）原液。

加入适宜稳定剂，除菌过滤后保存于适宜的温度，并规定其有效期。

2.2.7原液检定

按3.1项进行。

2.3半成品

2.3.1配制与除菌

2.3.1.1稀释液配制

按经批准的配方配制稀释液。

配制后应立即用于稀释。

2.3.1.2稀释与除菌

将检定合格加稳定剂的人白介素-2（I）原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。

除菌过滤后即为半成品，保存于2-8℃。

2.3.2半成品检定

按3.2项进行。

2.4成品

2.4.1分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

2.4.2分装及冻干

应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。

2.4.3规格

应为经批准的规格。

2.4.4包装

应符合“生物制品包装规程”规定。

3检定

3.1原液检定

3.1.1生物学活性

依法测定（附录ⅩD）。

3.1.2蛋白质含量

依法测定（附录ⅥB第二法）。

3.1.3比活性

为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×107IU。

3.1.4纯度

3.1.4.1电泳法

依法测定（附录ⅣC）。

用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。

经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。

3.1.4.2高效液相色谱法

依法测定（ⅢB）。

色谱柱以适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量不低于20μg，于波长280nm处检测，以人白介素-2色谱峰计算理论板数应不低于1500。

按面积归一化法计算，人白介素-2（I）主峰面积应不低于总面积的95%。

3.1.5分子量

依法测定（附录ⅣC），用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为15.5kD±1.55kD。

3.1.6外源性DNA残留量

每1次人用剂量应不高于10ng（ⅨB）。

3.1.7宿主菌蛋白残留量

应不高于总蛋白质的0.10%（附录ⅨC）。

3.1.8残余抗生素活性

依法测定（附录ⅨA），不应含有残余氨苄西林或者其他抗生素活性。

如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.01%进行测定。

3.1.9细菌内毒素检查

每300万IU应小于10EU（附录ⅫE凝胶限量试验）。

如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至