核酸化学3.ppt
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第14章核酸的物理化学性质一、核酸的水解
(一)酸水解糖苷键比磷酸酯键更易水解,特别是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键很容易水解。
(二)碱水解通常用于RNA水解,DNA的碱水解比较困难。
HydrolysisofRNAunderalkalineconditions.The2hydroxylactsasanucleophileinanintramoleculardisplacement.The2,3-cyclicmonophosphatederivativeisfurtherhydrolyzedtoamixtureof2-and3-monophosphates.DNA,whichlacks2hydroxyls,isstableundersimilarconditions.Cleavageinpolynucleotidechains:
acleavageyields5-phosphateproducts,whereasbcleavagegives3-phosphateproducts.(三)酶水解Snakevenomphosphodiesteraseandspleenphosphodiesteraseareexonucleasesthatdegradepolynucleotidesfromoppositeends.Anexampleofnucleasespecificity:
ThespecificityofRNAhydrolysisbybovinepancreaticRNase.ThisRNasecleavesbat3-pyrimidines,yieldingoligonucleotideswithpyrimidine3-PO4ends.DNADNADNADNA与限制性内切酶与限制性内切酶与限制性内切酶与限制性内切酶双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶(restrictionenzyme)切断,又可以再连接起来。
切断的过程不需要能量,而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。
这就是分子克隆和DNA重组技术的基础。
大部分限制性内切酶识别的碱基序列为46个碱基的palindrome顺序。
它们在微生物细胞内发挥的是防御外来DNA入侵的国防军的作用。
二、核酸的酸碱性质碱基配对时碱基一般以酮式存在,而不是醇烯式。
碱基中的H原子一般不移动,因此很少有亚氨基团。
在中性pH条件下,参与氢键的-NH2基均不带电荷,这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果,否则双螺旋结构不会稳定。
碱基碱基adenine4.15,9.8cytosine4.5,12.2guanine3.2,9.6thymine9.9,13核苷核苷adenosine3.5,12.5deoxyadenosine3.8cytidine4.15,12.5deoxycytidine4.3,13guanosine1.6,9.2deoxyguanosine2.5uridine9.2,12.5deoxythymidine9.8,13核苷酸核苷酸AMP3.7,6.1:
dAMP4.4ADP3.9,6.3:
-CMP4.5,6.3:
dCMP4.6GMP2.4,6.1,9.4:
dGMP2.9,9.7UMP6.4,9.5:
dTMP10.0碱基、核碱基、核苷、核苷苷、核苷酸的酸的pK值值HClNaOH不存在自由的不存在自由的第二磷酸基第二磷酸基亚氨基缓冲区亚氨基缓冲区烯醇式羟基缓冲区烯醇式羟基缓冲区由双链变为单链由双链变为单链由单链变为双链由单链变为双链三、核酸的紫外吸收在光径为在光径为1cm1cm时,若时,若AA260260为为11,则溶液中核酸的含量,则溶液中核酸的含量为:
为:
dsDNA50dsDNA50gg;ssDNAssDNA3737gg;RNA40RNA40gg,或者,或者说,测得某核酸溶液的说,测得某核酸溶液的AA260260后,计算其核酸浓度的公式后,计算其核酸浓度的公式为:
为:
DAN(g/mL)=A260/0.020RAN(g/mL)=A260/0.025DNADNADNADNA分子的变性分子的变性分子的变性分子的变性四、核酸的变性,复性及杂交
(一)变性变性和复性的含义HeatdenaturationofDNA.(a)Thedenaturation,ormelting,curvesoftwoDNAspecimens.Thetemperatureatthemidpointofthetransition(Tm)isthemeltingpoint;itdependsonpHandionicstrengthandonthesizeandbasecompositionoftheDNA.(b)RelationshipbetweentmandtheGCcontentofaDNA.影响Tm的因素1.DNA的均一性越高,Tm的温度范围越小。
2.G-C含量越高,Tm的值越大,若GC的含量上升1%,则Tm上升0.4。
马默多蒂(Marmur-Doty)关系式:
Tm=69.3+0.41(G+C)%,或GC%=(Tm-69.3)2.443.介质的离子强度较高时,Tm的值较大。
4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH降低Tm的值。
5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。
HeatdenaturationofDNAfromvarioussources,so-calledmeltingcurves.Themidpointofthemeltingcurveisdefinedasthemeltingtemperature,Tm.SSC溶液,常用于溶液,常用于DNA的溶解。
的溶解。
Thedependenceofmeltingtemperatureonrelative(G+C)contentinDNA.NotethatTmincreasesifionicstrengthisraisedatconstantpH(pH7);0.01Mphosphate+0.001MEDTAversus0.15MNaCl/0.015MNacitrate.In0.15MNaCl/0.015MNacitrate,duplexDNAconsistingof100%A:
Tpairsmeltsatlessthan70oC,whereasDNAof100%G:
ChasaTmgreaterthan110oC.
(二)复性StepsinthethermaldenaturationandrenaturationofDNA.Thenucleationphaseofthereactionisasecond-orderprocessdependingonsequencealignmentofthetwostrands.Thisprocesstakesplaceslowlybecauseittakestimeforcomplementarysequencestoencounteroneanotherinsolutionandthenalignthemselvesinregister.Oncethesequencesarealigned,thestrandszipperupquickly.影响复性速度的因素1.DNA的片段越大,复性的速度越慢;2.DNA的浓度越高,复性的速度越快;3.DNA的重复序列越多,复性的速度越快;4.溶液的pH过高或过低,复性的速度均会降低;5.适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。
T1/2CconstDNADNA浓度与复性浓度与复性时间时间的关系的关系Thesec0tcurvesshowtheratesofreassociationofdenaturedDNAfromvarioussourcesandillustratehowtherateofreassociationisinverselyproportionaltogenomecomplexity.TheDNAsourcesareasfollows:
poly+polyU,asyntheticDNAduplexofpolyAandpolyUpolynucleotidechains;mousesatelliteDNA,afractionofmouseDNAinwhichthesamesequenceisrepeatedmanythousandsoftimes;MS-2dsRNA,thedouble-strandedformofRNAfoundduringreplicationofMS-2,asimplebacteriophage;T4DNA,theDNAofamorecomplexbacteriophage;E.coliDNA,bacterialDNA;calfDNA(nonrepetitivefraction),mammalianDNA(calf)fromwhichthehighlyrepetitiveDNAfraction(satelliteDNA)hasbeenremoved.Arrowsindicatethegenomesize(inbp)ofthevariousDNAs.DNADNADNADNA复性与复性与复性与复性与CotCotCotCot分析分析分析分析当C/C0=1/2时,k=1/C0t1/2哺乳动物的DNA一般均呈右图的曲线,这是因为它们的基因组DNA中插入了大量的重复序列,如人的DNA中就插入了长度为350bp的Alu序列达50万份拷贝之多。
人人人人DNADNADNADNA的的的的CotCotCotCot曲线曲线曲线曲线(三三三三)DNA)DNA的分子杂交技术的分子杂交技术的分子杂交技术的分子杂交技术分子杂交分子杂交是将不同来源的核酸分子分别变性,再混合后复性,使不同来源的单链的互补区形成双链的技术。
通常将其中的一方用放射性同位素放射性同位素或特定的基团(如生生物素物素,地高辛地高辛)标记,称作探针,探针,现时的探针多为人工合成的短片段。
若将杂交的另一方直接点到膜上进行杂交,称作点杂点杂交。
交。
对组织切片或菌落进行处理后再杂交称作原位杂交。
原位杂交。
分子杂交的广泛应用是将样品DNADNA用限制性内切酶切割限制性内切酶切割成一定大小的片段,进行变性凝胶电泳,变性凝胶电泳,将凝胶电泳形成的DNADNA区带转移到膜上转移到膜上再进行杂交,这种技术称作SouthernSouthern杂交。
杂交。
将RNARNA凝胶电泳形成的区带转移到膜上再进行杂交称作NorthernNorthern杂交。
杂交。
将蛋白质蛋白质凝胶电泳形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作WesternWestern印迹技术。
印迹技术。
将蛋蛋白质等点聚焦白质等点聚焦形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作EasternEastern印迹技术。
印迹技术。
分子杂交技术在现代生命科学中的应用十分广泛。
将人工合成的探针探针用点样机点到玻璃或塑料基片上形成高密度的阵列,阵列,将样品样品DNA用限制性内切酶切割
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