第2次课细菌分离培养与生化鉴定.docx
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第2次课细菌分离培养与生化鉴定
第2次课细菌分离培养与生化鉴定
LabofmedicalmicrobiologyandParasitology_02
Isolationandcultureofthebacteria
1.自学/讲解:
细菌生长条件
2.示教:
细菌接种
3.示教观察:
细菌在液体、固体斜面、半固体、平板的生长状态
4.示教观察:
细菌生化反应(培养基、原理、结果、讨论)
5.操作:
空气中的细菌(每组,普通琼脂平板)
6.操作:
手指皮肤的细菌(每组,普通琼脂平板)
7.操作:
健康人咽喉部细菌的分离(每人,咽拭子、血平板)
8.思考题:
咽喉部细菌分离鉴定程序(每人)
实验报告要求
1.示教观察:
细菌在液体、固体斜面、半固体、平板的生长状态
2.示教观察:
细菌生化反应(培养基、原理、结果、讨论)
3.思考题:
咽喉部细菌分离鉴定程序
细菌在培养基中的生长现象
固体培养基
液体培养基
半固体培养基
菌落:
指单个细菌在平板培养基上生长繁殖,形成单一肉眼可见的细菌集团。
菌落特征:
大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。
菌苔:
指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。
沉淀—成链生长
浑浊—均匀分散生长
菌膜—表面生长(厌氧菌)
有鞭毛细菌:
在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长,穿刺线边缘模糊
无鞭毛细菌:
只沿穿刺线生长,穿刺线边缘清晰
结果展示
1、细菌生长条件
3、细菌培养
培养基(culturemedium)是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。
适宜的培养基能使细菌在体外迅速生长繁殖,便于对细菌进行分离和鉴别。
可分为基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。
(一)基础培养基 只含有细菌生长所需的最基本营养成分,应用最广泛,为制备多种培养基的基础,常见的有肉汤培养基、琼脂培养基。
(二)营养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物,可供营养要求较高的细菌生长需要或增菌用。
如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。
(三)选择培养基 利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成,使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的培养基。
培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳,有利于目的菌的检出和识别。
选择培养基多为固体平板,用于从标本中分离某些特定的细菌。
(四)鉴别培养基培养基中加有某些特定成分,如糖、醇类和指示剂等,用于检查细菌的各种生化反应,以资鉴别和鉴定细菌。
(五)厌氧菌用培养基 专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长,故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂,降低培养基中氧化还原电势,并应与外界空气隔绝,使培养基本身为无氧的环境。
(六)特殊培养基 为某些需要在特殊条件下才能生长的细菌培养之用。
如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养基、改良Kagan氏培养基等。
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①液体培养基(liquidmedium):
液体培养基不含任何凝固剂,菌体与培养基充分接触,操作方便,常用于大规模的工业生产以及在实验室进行微生物生理代谢等基本理论的研究工作。
可据培养后的浊度判断微生物的生长程度.
②固体培养基(solidmedium):
天然固体营养基质制成的培养基,或液体培养基中加入一定量凝固剂(琼脂1.5~2%)而呈固体状态的培养基。
为微生物的生长提供营养表面。
常用于微生物的分离、纯化、计数等方面的研究。
可依使用目的不同而制成斜面、平板等形式.
③半固体培养基(semi-solidmedium):
在液体培养基中加入0.2-0.7%的琼脂构成的培养基。
常用来观察细菌运动的特征,以进行菌种鉴定和噬菌体效价滴定等方面的实验工作。
细菌培养必须随时为防止污染和病原菌的扩散而进行操作,即无菌操作。
细菌检验室的注意事
项如下:
1.细菌的培养应在接种罩或无菌室内进行。
有条件的实验室可在超净工作台内进行。
2.用接种环分离和移种细菌时,用前用后均需灭菌处理。
一般采用火焰灭菌法。
3.从培养瓶或试管培养物中取标本或移种时,在打开瓶口、管口或关闭前,均要在火焰上通过
2~3次。
切不可将含菌材料污染台面和其他物体。
4.如不慎将试管等打破造成菌液污染时,不要惊慌,应立即报告负责人,然后用3%来苏或5%石炭酸处理污染台面或地面,至少浸泡30分种。
5.工作完毕后,用紫外光灯照射30分钟,或用3%来苏擦拭台面,并清洗双手。
接种环和接种针使用
接种环和接种针由三部分组成,即环(针)部分、金属柄部分和绝热柄部分。
接种环和接种针
通常选用电热(镍)丝,环的直径随使用目的而不同,一般多为2~4mm,环和针的长度为40~
50mm。
接种环(针)使用前后均应进行灭菌处理,将接种环(针)末端直立火焰中,烧红镍丝部分,
再使接种环(针)金属柄旋转通过火焰3次灭菌,冷却后用以取菌或待试标本。
使用接种环(针)完毕后立即将染菌的镍丝部分于还原焰(内焰)中加热,烤干环(针)端附着的细菌或标本,以免环(针)上残余的细菌或标本因突受高热,爆烈四溅,而污染环境和导致传染危险。
然后再移于氧化焰(外焰)中烧红灭菌,最后将金属柄部分往复在火焰中通过3次。
用完后的接种环(针),应立即搁置于架上,切勿随手弃置,以免灼焦台面或其他物件。
接种操作区
为避免在接种过程中污染环境以及空气中的细菌污染培养物,接种均应在接种罩或无菌室内进
行,此外细菌学实验室所必需的设备还包括无菌工作台、生物安全柜和生物安全实验室。
(一)接种罩 接种罩的式样很多,可用木框和玻璃制成,亦有用有机玻璃制成。
接种罩在用
前先以3%石炭酸或来苏轻拭,内需装有紫外线杀菌灯,用前可先行照射,以保证罩内无尘埃和细菌。
操作结束后,应立即清理内部,并作罩内消毒处理。
(二)无菌工作台 又称超净工作台(supercleanbench),目前多采用垂直层流的气流形式。
通过变速离心风机将负压箱内经过预滤器过滤的空气压入静压箱,再经高效过滤器进行二级过滤,从出风面吹出的洁净气流,以一定的和均匀的断面风速通过工作区时,将尘埃颗粒和微生物颗粒带走,从而形成无尘无菌的工作环境。
使用时应提前50分钟打开紫外线杀菌灯,30分钟后关闭并启动送风机。
净化区内严禁存放不必要的物件,以保持洁净气流型不受干扰。
(三)无菌室 无菌室又称洁净室(cleanroom),是在实验室内部安装的用于无菌操作的小室。
室内应有空气过滤装置、紫外线杀菌灯等。
(四)生物安全柜(biologicalsafetycabinet,BSC)目前微生物试验中多采用生物安全柜,是为操作原代培养物、菌(毒)株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时,用来保护操作
者本人、实验室环境以及实验材料,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的负压过滤排风柜。
(五)生物安全实验室(BiosafetyLaboratory),简称“BSL实验室”,是指通过规范的实验设计、实验设备的配置、个人防护装备的使用等建造的实验室。
在结构上由一级防护屏障(安全设备)和二级防护屏障(设施)构成,实验室生物安全防护的安全设备和设施的不同组合,构成了四级生物安全防护水平,一级为最低。
接种法
根据待检标本的性质,培养目的及所用培养基的种类,采用不同的接种方法。
常用的有平板划
线分离培养法、斜面接种法、液体接种法和穿刺接种法。
(一)平板划线分离培养法
分离培养法就是通过划线使标本或培养物中混杂的多种细菌在培养基表面逐一分散生长,各自
形成菌落,以便根据菌落形态及特征,挑选单个菌落,经过移种而获得纯种细菌(纯培养)。
分离细菌最常用的为平板划线分离法。
分区划线法:
适用于含菌量较多的标本。
连续划线法:
适用于含菌量较少的标本。
1.将接种环火焰灭菌,待冷却后取标本或混合菌液。
2.用左手持起平板,使平皿盖向上放于台面上或打开平皿盖。
3.左手斜持(45℃角)平板,右手持已取材的接种环,在酒精灯上方5~6cm处作连续划线法分离细菌。
划线时,接种环与平板呈30~40°角,轻轻接触平板,以腕力平行滑动接种环。
应避免将琼脂划破。
先在平板上l/5处轻轻涂布,然后即可左右来回以作连续划线接种,线与线间留有适当距离,做到线密而不重复,将整个平板表面布满划线。
如果菌量较大可采用分区划线法。
可将平皿分为若干个区(一般为5个区)。
先在平板上l区轻轻涂布,再在2,3……区划线。
每划完一个区域,均将接种环灭菌一次,冷后再化下一个区域。
每一区域的划线均接触上一区域的接种线l~2次,使菌量逐渐减少,以获得单个菌落。
4.划线完毕,盖好皿盖,做好标记将平皿倒置,置37℃培养18~24小时后观察结果。
(二)斜面接种法
主要用于划线分离培养所获得的单个菌落的移种,以得到纯种细菌和保存菌种,以及观察细菌
的某些培养特性。
1.取菌种管置左手食指、中指、无名指之间,拇指压住管底部上侧面。
2.火焰灭菌接种环。
3.以右手小指与手掌拔取棉塞(如同时持有两管,可用小指与无名指拔取另一棉塞),将管口
迅速通过火焰l~2次。
4.将已灭菌的接种环伸入菌种管中,从斜面上取少许菌,迅速伸入待接种的培养基管中,在斜
面底部向上划一条直线,然后从底部起向上作曲折连续划线,直至斜面上方顶端。
37℃孵箱中培养18~24小时即可观察结果。
(三)液体接种法
肉汤、胨水、发酵管等均系液体培养基。
用于增菌,观察细菌生长现象和检测细菌的生化反应
等。
1.持好菌种管及培养基管。
2.灭菌接种环,由菌种管取菌,伸入培养基管中,在接近液面的管壁上方轻轻研磨,并沾取少
许培养基液体调和,使接种物充分混合于培养基的液体中。
3.液体培养一般以18~24小时观察生长特征为好。
(四)穿刺接种法
试管内半固体培养基采用此法接种,多用于保存菌种、观察动力及做厌氧培养等。
亦可用于观
察细菌的某些生化反应。
1.持好菌种管和培养基管。
2.以灭菌接种针从菌种管取菌。
3.接种针直刺入培养基的中心(半固体或一般琼脂高层)直达管底部(深入培养基3/4处)或
沿管壁刺入(醋酸铅高层),接种后接种针应沿原路退出。
4.经培养后即可观察结果。
沿穿刺线生长,线外的培养基清亮者表示细菌无动力;穿刺线模糊
不清,或沿穿刺线向外扩散生长,或整个培养基混浊者表示细菌有动力。
将上述已接种细菌的培养基置37℃恒温培养箱中孵育18~24h,观察细菌的生长现象
Resultdescription
questionsraisedfromclass2013-09-16pmA307
1.如何检测固体培养基是否无菌?
2.吲哚实验中,吲哚试剂未能使阳性标本显色的可能原因?
3.试述细菌标本采集与送检的基本原则。
4.糖发酵实验放置小倒管的原因及方法?
5.什么叫IMViC实验,其用途是什么?
6.琼脂在培养基制备中的用途是什么?
7.普通琼脂平板与血琼脂平板的区别是什么?
8.为什么要进行细菌纯培养?
9.细菌分离培养的目的是什么?
10.平板分离划线接种法-影响因素与注意事项?
11.半固体培养基接种时,为什么接种针要直上直下?
additionalquestionsraisedfromclass2013-09-17amA301
1.液体培养基接种时,要求接种环不要与液体直接接触。
可能的原因是什么?
additionalquestionsraisedfromclass2013-09-17pmA307
1.血-琼脂培养基的成分?
2.菌苔与菌落的区别?
3.糖发酵实验中如何放置小倒管,以确保其中没有气体?
4.接种环划破的琼脂表面,细菌无法生长,可能的原因是什么?
5.固体斜面培养基接种,为什么要先自下而上沿正中划一条线?
additionalquestionsraisedfromclass2013-09-18pmA307
1.平板分离划线,四区的菌落往往比2、3区密集的菌落要大。
可能的原因是什么?
2.固体斜面、固体平板、半固体、液体培养基的区别及各自的用途?
3.导致细菌在肉汤培养基中生长3种状态的可能原因是什么?
4.菌落与菌膜的区别?
Refference:
慢性咽炎患者咽部细菌调查分析
目的分析慢性咽炎患者咽部细菌学特征。
方法对136例慢性咽炎患者的咽分泌物进行细菌培养、分离和鉴定。
结果共检测出细菌385株,分布最多的为α-溶血性链球菌、副流感嗜血菌和卡他莫拉菌,构成比分别为18.44%、9.87%和9.09%;病原菌315株,占81.82%;3种咽炎病类型中检测到最多的均是α-溶血性链球菌。
结论咽部菌群紊乱是慢性咽炎病发作的主要原因,治疗前应进行细菌学检查,避免因滥用抗菌药物造成无效或菌群失调。
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- 关 键 词:
- 第2次课 细菌分离培养与生化鉴定 细菌 分离 培养 生化 鉴定