分子生物学第六章.ppt
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分子生物学第六章.ppt
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聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)PCR是利用热稳定是利用热稳定DNA聚合酶在体外快速聚合酶在体外快速扩增扩增(复制复制)某一特定某一特定DNA片段的方法。
片段的方法。
PCR原理原理1983发明发明PCR技术技术;1993获得诺贝尔化学奖获得诺贝尔化学奖KaryB.Mullis美国美国Yellowstone公园的公园的热泉热泉嗜热水生细菌嗜热水生细菌(Thermusaquaticus)TaqDNA聚合酶聚合酶3D结构结构PCR过程过程1.模板变性模板变性(Denaturation)双链双链DNA模板在模板在95C变变性性为单链为单链DNA。
2.引物退火引物退火(Annealing)引物与单链引物与单链DNA互补并互补并退退火。
火。
3.延伸反应延伸反应(Extention)热稳定热稳定DNA聚合酶催化子聚合酶催化子链的合成。
链的合成。
缓冲液缓冲液(Tris-HCl,KCl)MgCl2或或MgSO4DNA模板模板上游引物上游引物(upstreamprimer,senseprimer)下游引物下游引物(downstreamprimer,antisenseprimer)底物底物dNTPs热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶PCR反应体系反应体系1.长度:
长度:
18-24个核苷酸;个核苷酸;2.GC:
40-60;引物设计的原则引物设计的原则引物长度引物长度为为18-24个碱基个碱基:
Tm(C)4(GC)2(AT)5ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG3GC12;AT8Tm4X122X864C3.四种碱基随机分布;四种碱基随机分布;4.引物自身不应存在互补序列,以防引物自身不应存在互补序列,以防形成发夹结构;形成发夹结构;5GTTGACTTGATAT3GAACTCT5GTTGACTTGATATTCTCAAG3引物的自身互补序列形成发夹结构引物的自身互补序列形成发夹结构5ACCGGTAGCCACGAATTCGT33TGCTTAAGCACCGATGGCCA55ACCGGTAGCCACGAATTCGT3两个引物分子形成二聚体两个引物分子形成二聚体5.引物之间不应存在互补序列,以防形成二聚体引物之间不应存在互补序列,以防形成二聚体(dimer);6.引物的引物的5端可添加限制性内切酶识别位点,便于端可添加限制性内切酶识别位点,便于PCR产物的定向克隆。
产物的定向克隆。
5CATATG33TTCGAA5NdeIHindIIIDNA聚合聚合酶来来源源PCR产物物末端末端35外切外切酶活性活性(校正校正)TaqDNA聚合聚合酶Thermusaquaticus3A无无PfxDNA聚合聚合酶Thermococcussp.KOD平端平端有有PfuDNA聚合聚合酶Pyrococcufuriosus平端平端有有PwoDNA聚合聚合酶Pyrococcuwoesei平端平端有有VentDNA聚合聚合酶Thermococcuslitoralis平端平端有有DeepVentDNA聚合聚合酶Pyrococcusp.GB-D平端平端有有UITmaDNA聚合聚合酶Thermotogamaritima平端平端有有TthDNA聚合聚合酶Thermusthermophilus3A无无常用的常用的热热稳定稳定DNA聚合酶聚合酶待扩增片段:
待扩增片段:
1000bp引物引物Tm55DNA模板变性模板变性:
94,5分钟分钟;PCR循环循环(30次次):
94,30秒秒;50,30秒秒;72,1分钟分钟;最终延伸最终延伸:
72,7-10分钟分钟PCR反应条件的设定反应条件的设定PCR产物的检测产物的检测-琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR产物产物PCR产物产物逆逆转录酶转录酶以以mRNA为模板合成为模板合成第第1条条cDNA链,然后通过链,然后通过PCR反反应扩增出许多应扩增出许多cDNA分子拷贝。
用于分子拷贝。
用于检测某一基因在转录水平的表达检测某一基因在转录水平的表达及克隆特异的及克隆特异的cDNART-PCR一步法一步法RT-PCRRT反应与反应与PCR反应在反应在同一个试管中进行。
同一个试管中进行。
两步法两步法RT-PCRRT反应与反应与PCR反应在反应在不同的试管中进行。
不同的试管中进行。
下游引物下游引物特异性引物特异性引物Oligo(dT)-actinGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)18SrRNA用用作作内参内参的管家基因的管家基因RealTimeQuantitativePCR,qRT-PCR在在PCR反应体系中加入荧光报告基团,利用荧光信号的反应体系中加入荧光报告基团,利用荧光信号的积累实时监测积累实时监测PCR反应进程,对扩增的反应进程,对扩增的PCR产物进行定量产物进行定量分析的方法。
分析的方法。
具有高度敏感性:
用于检测微量的具有高度敏感性:
用于检测微量的DNA或或RNA样品样品;检测每一次检测每一次PCR循环中产物的积累;循环中产物的积累;扩增反应结束后不需要对扩增反应结束后不需要对PCR产物进行电泳。
产物进行电泳。
1.基础研究基础研究
(1)基因克隆:
从核酸数据库中获得特定基因的核苷酸序列,设计引物。
基因克隆:
从核酸数据库中获得特定基因的核苷酸序列,设计引物。
(2)cDNA克隆:
从核酸数据库中获得特定克隆:
从核酸数据库中获得特定cDNA(mRNA)的核苷酸序列,的核苷酸序列,设计引物设计引物。
(3)基因基因定向突变定向突变(Site-specificmutagenesis):
引物含有突变的碱基。
引物含有突变的碱基。
(4)基因表达:
用基因表达:
用RT-PCR或或qRT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表检测某一特定基因在转录水平的表达。
达。
2.医学医学
(1)感染性疾病病原体的诊断:
感染性疾病病原体的诊断:
HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。
结核分枝杆菌、乙肝病毒等。
(2)遗传病相关基因的检测:
镰刀型细胞贫血、血友病。
遗传病相关基因的检测:
镰刀型细胞贫血、血友病。
(3)恶性肿瘤的诊断恶性肿瘤的诊断3.基因动、植物的检测基因动、植物的检测
(1)转基因动物的检测:
检测某一基因的遗传稳定性。
转基因动物的检测:
检测某一基因的遗传稳定性。
(2)转基因植物的检测:
玉米、大豆等。
转基因植物的检测:
玉米、大豆等。
PCR技术的应用技术的应用正常人血红蛋白正常人血红蛋白亚基亚基镰刀型贫血病人血红蛋白镰刀型贫血病人血红蛋白亚基亚基镰刀型贫血病人血红蛋白镰刀型贫血病人血红蛋白亚基编码基因亚基编码基因正常人血红蛋白正常人血红蛋白亚基编码基因亚基编码基因PCRDdeI酶切酶切琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳核酸分子杂交核酸分子杂交(Hybridizationofnucleicacids)核酸分子杂交核酸分子杂交两条互补的两条互补的DNA单链或一条单链或一条DNA单链与单链与其其互补的互补的RNA链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交。
链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交。
核酸分子杂交核酸分子杂交通常是通常是指指探针与受体探针与受体DNA或或RNA分分子的之间的杂交。
子的之间的杂交。
探针探针(probe)用同位素或非同位素标记的序列已知的核苷酸链用同位素或非同位素标记的序列已知的核苷酸链(单单链链DNA或或RNA分子分子)称为探针。
称为探针。
探针探针用于鉴别、分离基因以及检测基因的表达。
用于鉴别、分离基因以及检测基因的表达。
核酸分子杂交类型及特点核酸分子杂交类型及特点转膜转膜(印迹印迹)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳制备受体制备受体DNA/RNA洗膜洗膜检测探针检测探针制备探针制备探针预杂交预杂交杂交杂交一、探针的标记一、探针的标记1.同位素标记的探针同位素标记的探针常用的同位素为常用的同位素为32P、35S2.非同位素标记的探针非同位素标记的探针高度灵敏感高度灵敏感;便于检测便于检测利用显色反应、化学发光法、荧光素、若丹明利用显色反应、化学发光法、荧光素、若丹明(rhodamine)等检测杂交的探针等检测杂交的探针;探针稳定,并且可被反复使用多次;探针稳定,并且可被反复使用多次;不会危害操作者的健康并且不污染环境;不会危害操作者的健康并且不污染环境;常用的非同位素标记常用的非同位素标记地高辛地高辛(Digoxigenin,DIG)生物素生物素(Biotin)3DIG标记标记探针的方法探针的方法二、二、DNA/RNA样品的制备及电泳样品的制备及电泳1.DNA样品样品制备基因组制备基因组DNA;限制性内切酶酶切基因组限制性内切酶酶切基因组DNA;用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组DNA2.RNA样品样品制备总制备总RNA;用变性琼脂糖凝胶电泳分离用变性琼脂糖凝胶电泳分离RNA三、三、DNA/RNA从凝胶向膜的转移从凝胶向膜的转移-印迹印迹(blotting)1.转移方法转移方法毛细管转移毛细管转移(Capillarytransfer)在缓冲液中,在缓冲液中,DNA或或RNA从凝胶中被动地转移到膜上。
从凝胶中被动地转移到膜上。
真空转移真空转移(Vacuumblotting)电转移电转移(Electroblotting)电流加快转移速度,适用于聚丙烯酰胺凝胶。
电流加快转移速度,适用于聚丙烯酰胺凝胶。
2.膜支持物膜支持物尼龙膜尼龙膜(Nylonmembrane)硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜(Nitrocellulosemembrane)毛细管转移毛细管转移四、将四、将DNA/RNA固定在膜上的方法固定在膜上的方法1.干烤干烤置尼龙膜于抽真空的置尼龙膜于抽真空的120C烤箱中烤箱中2小时;小时;置硝酸纤维素膜于抽真空的置硝酸纤维素膜于抽真空的80C烤箱中烤箱中2小时。
小时。
2.UV交联作用交联作用用用UV将将DNA/RNA固定在尼龙膜上。
固定在尼龙膜上。
UV交联仪交联仪(UVCrosslinker)五、五、DIG探针与靶分子的杂交探针与靶分子的杂交1.探针探针杂交前用热变性方法将双链杂交前用热变性方法将双链DNA探针变性为单链探针变性为单链DNA探针。
探针。
2.杂交条件杂交条件保证探针与靶分子特异杂交。
保证探针与靶分子特异杂交。
3.洗膜洗膜使探针与非特异杂交的序列分离。
使探针与非特异杂交的序列分离。
探针与靶分子的杂交探针与靶分子的杂交六、六、DIG探针的检测探针的检测1.在抗在抗DIG抗体上偶联荧光素抗体上偶联荧光素用于原位杂交用于原位杂交2.在抗在抗DIG抗体上偶联抗体上偶联碱性磷酸酶碱性磷酸酶,以碱性磷酸酶催,以碱性磷酸酶催化的底物显色反应或化学发光反应检测化的底物显色反应或化学发光反应检测DIG探针信探针信号。
号。
用于显色反应的底物用于显色反应的底物NBT(氮蓝四唑盐酸盐氮蓝四唑盐酸盐)BCIP(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸盐吲哚磷酸盐)用于化学发光反应的底物用于化学发光反应的底物CSPD和和CDP-Star用碱性磷酸酶检测用碱性磷酸酶检测DIG探针探针显色反应的底物:
显色反应的底物:
NBT,BCIP化学发光反应的底物:
化学发光反应的底物:
CSPD,CDP-Star化学发光化学发光反应反应显色反应显色反应Southern印迹印迹将将变性的变性的DNA分子分子(单链单链)转印到转印到尼龙尼龙膜上膜上琼脂糖凝胶电泳分离酶切的琼脂糖凝胶电泳分离酶切的DNA片段片段用限制性内切酶酶切基因组用限制性内切酶酶切基因组DNA预杂交:
降低探针与膜结合的机
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- 分子生物学 第六