反相高效液相色谱法测定食用植物油中维生素E的含量.docx
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反相高效液相色谱法测定食用植物油中维生素E的含量
反相高效液相色谱法测定食用植物油中维生素E的含量
摘要:
,高效液相色谱法、δ-生育酚、γ-生育酚、α-生育酚关键词:
维生素E
第一章绪论
1选题的目的和意义
维生素E是具有α-生育酚生物活性的生育酚和三烯生育酚及其衍生物的总称。
它们都是苯并二氢吡喃的衍生物。
2高效液相色谱法简介
3国内外研究进展
4主要研究内容
第二章高效液相色谱法色谱条件的优化引言由于维生素E结构复杂,异构体种类多,分析测定相对困难,现已知的分析方法有气相色谱法、紫外分光光度计法、电化学分析法、比色法、荧光法、
。
前面几种方法大都需要较复杂的样品前处理过程,增加了试高效液相色谱法等
验难度,而且测定的结果受到多种因素的影响。
高效液相色谱法是近年来发展起来的一种分析技术,用来分析维生素E能简化样品处理的步骤,相较其他方法具有色谱柱温度条件相对温和,物质组分分离速度快,灵敏度高,重复性好,干扰小等优点,明显优于其他几种检测方法,成为实际检验工作中测定VE最普遍的方法。
高效液相色谱法又分为正相色谱法及反相色谱法。
正相色谱法的流动相大多为有毒有害的且易挥发的有机溶剂,故一般采用反相色谱柱进行分析。
反相键合相色谱是在ODS(C)柱上,采用甲醇-水或者乙腈-水作流动相,分离非18
极性或中等极性的化合物如同系物,稠环芳烃、药物、急速、天然产物及农药残
[1]留量等。
色谱柱的稳定性比较高,保留时间短,重现性好,容易平衡等优点,而且一般以水和甲醇作为流动相,减少了有毒有害溶剂的使用。
在高效液相色谱中,影响分离效果的好坏的其中一个重要指标是色谱填料的选择,反相色谱用的填料通常是以硅胶为基质,表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。
反相色谱所使用的流动性极性较强,通常为水、缓冲溶液与甲醇、乙腈等的混合物。
样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出,而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。
常用的反相填料由:
C(ODS),C(MOS),C(Butyl)、CH188465(Phenyl)等。
本试验选用的是C色谱柱。
紫外吸收检测器是一种选择性的浓18
度型检测器,是HPLC中应用最早、最广泛的检测器之一,原理是通过测定物质在流动池中吸收紫外光的大小确定其含量,优点是不仅灵敏度高和选择性高,而且对环境温度、流动相的流速波动和组成变化不敏感。
试验时选用的紫外检测器。
目前有相关标准及文献介绍了VE的测定方法,但是色谱条件各不一样本试验根据以下相关标准及文献的色谱条件选取合适的水平进行试验分析,对波长、流动相比例、柱温、流速做单因素实验从而选取每个因素的三个最佳水平进行试验设计。
分离度为色谱柱的总分离效能指标,既反映柱效率又能反映选择性,其定义为相邻两组分的色谱峰保留值之差与峰底宽总和一半的比值。
本试验测定维生素E的三种单体,观察色谱图可知,三种单体的色谱峰都能完全分离,峰
形尖细,故以色谱峰的保留时间来定性峰面积来定量,选用第一个色谱峰出峰时间及VE三种单体色谱峰的峰面积作为评定值,以确定测定维生素E的最佳色谱条件即第一个单体保留时间最短,峰面积响应值最大。
初始色谱条件为:
紫外检测波长300nm,流动相为甲醇+水=98+2,流速1.0ml/min,柱温30?
,进样量10ul。
相关标准及文献VE测定色谱条件比较如表1所示。
表1色谱条件比较
标准及文献紫外检测器波长流动相比例柱温流速NY/T1598-2008300nm甲醇+水=98+230?
未规定GB/T5009.82-2003300nm甲醇+水=98+2未规定1.7ml/minGB/T17812-2008280nm甲醇+水=95+5室温1.0ml/minGB/T9695.30-2008292nm甲醇30?
1.0ml/minGB/T5413.9-2010294nm甲醇35?
?
1?
1.0ml/min[2]文献2荧光检测器甲醇+水=98+235?
1.0ml/min[3]文献3292nm甲醇+水=98+240?
1.0ml/min[4]文献4298nm甲醇+水=99+125?
1.7ml/min[5]文献5荧光检测器甲醇+水=98+2室温0.8ml/min1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1化学试剂
甲醇高效液相色谱淋洗剂HPLC国药集团化学试剂有限公司乙醇(无水乙醇)优级纯国药集团化学试剂有限公司无水乙醚分析纯衡阳市凯信化工试剂有限公司硝酸银分析纯国药集团化学试剂有限公司
碘化钾分析纯国药集团化学试剂有限公司
氢氧化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司
硫代硫酸钠分析纯国药集团化学试剂有限公司
氨水分析纯衡阳市凯信化工试剂有限公司gamma-Tocopherol25mg–NeatSUPELCOAnalyticaldelta-Tocopherol100mg–NeatSUPELCOAnalyticalDL-alphaTocopherol100mg–NeatSUPELCOAnalytical1.1.2试剂的处理
无水乙醚:
检查是否含有过氧化物,检查方法:
吸取5ml乙醚加入1ml10%的碘化钾溶液(100g/L),震摇1min,水层呈现黄色,则该乙醚需处理后使用。
去除过氧化物的方法:
乙醚加入一定量的硫代硫酸钠(50g/L)于梨形分液漏斗中震摇,静置,分取乙醚层,然后再用蒸馏水洗涤乙醚层2次,于水浴上蒸馏,弃去首尾蒸出的部分,收集馏出液,然后再次检查,直至不含过氧化物。
无水乙醇:
检查是否含有醛类物质,方法:
加一定量的氨水于硝酸银溶液(50g/L)中,直至生成的沉淀重新溶解,再加入几滴氢氧化钠溶液(100g/L),如再产生沉淀,则再加入氨水直至沉淀消失,此溶液则为银氨溶液。
吸取2ml银氨溶液于干净试管中,加入0.5ml乙醇,摇匀,再加入几滴氢氧化钠溶液(100g/L),于沸水浴上加热,放置冷却后,试管壁出现少量片状银镜,则乙醇需经过处理后使用。
脱醛方法:
称取4g硝酸银溶解于少量水中,称取8g氢氧化钠溶于温热的乙醇中,然后将两者倒入1L的乙醇中,充分震摇后,放置暗处2d(期间不时摇动),过滤后,于水浴中蒸馏,弃去初滤液,收集滤液,然后再检
查。
1.1.3仪器与设备
Waters高效液相色谱仪e2695配2489紫外检测器美国沃特斯有限公司色谱柱C柱(150mm×4.6mm,5um)18
1.2试验方法
1.2.1标准溶液的配制
天然维生素E同系物通常为透明、淡黄色粘稠油状物,无臭无味,比重为0.950(25?
),不溶于水,可溶于油、丙酮、乙醇、三氯甲烷和乙醚等脂溶[8]性溶剂。
因为乙醇要进行脱醛处理,故选择甲醇配制标准溶液。
将100mgδ-生育酚、100mgα-生育酚、25mgγ-生育酚用甲醇分别定容至100ml、100ml、50ml棕色容量瓶中,将其作为1mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml的储备液,放置冰箱保存;
移取一定体积的三种生育酚储备液,配制成1mg/ml、10mg/ml,40ug/ml,60mg/ml,100mg/ml,140mg/ml的浓度梯度的混合标准溶液。
1.2.2单因素试验
1.2.2(1波长的确定试验
以色谱条件为流动相:
甲醇+水(V+V)=98+2,柱温:
30?
,流速:
1.0ml/min,
,在紫外检测波长为280nm、290nm、292nm、294nm、300nm条件下进样量10uL
做单因素试验。
1.2.2.2流动相比例的确定试验
以色谱条件为紫外检测波长300nm,柱温:
30?
,流速:
1.0ml/min,进样
,在流动相甲醇和水的比例为95:
5、97:
3、98:
2、99:
1、100:
0条件下量10uL
做单因素实验
1.2.2.3流速的确定试验
因为柱效是色谱柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可以得到不同的柱效。
对于一根特定的色谱柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。
对内径4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。
故综合文献及流速对柱效的影响,选择以下5个水平做单因素试验。
以色谱条件为流动相:
甲醇+水(V+V)=98+2,柱温:
30?
,紫外检测波长300nm,进样量10uL,在流速为0.8、0.9、1.0、1.5、1.7ml/min条件下做单因素试验。
1.2.2.4柱温的确定试验
因为C柱推荐使用柱温为40?
,最高使用温度为50?
,故以色谱条件为18
流动相:
甲醇+水(V+V)=98+2,紫外检测波长:
300nm,流速:
1.0ml/min,进样量10uL,在柱温为25?
、30?
、35?
、40?
、45?
条件下做单因素试验。
1.2.3色谱条件优化试验
响应面法可以很好的反应各因素的与响应值之间的关系以及各因素之间的交互作用,借用其他统计软件还可以精确的预测最优工艺参数及其对应的响应值,但根据单因素结果可以看出,因素水平与评定值之间的关系大多为一定的递增或者递减趋势而不是有起落的峰形图,所做出的响应面液不是屋脊面,故本试验采用正交试验方法。
正交试验的结果分析有直观分析和方差分析2种,虽然直观分析法简便易懂,但是不能对试验结果中必然存在的误差大小予以无偏估计,不能确定其精确度,因而给试验的分析带来困难。
方差分析法要求用正交表设计[6]试验时,必须留有不排入因素或互作的空列以作为误差的估计值,故选取流动4相比例、流速、柱温三个因素的三个最佳水平做L(3)正交试验,重复次数为9
2次,确定最佳色谱条件。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1(1波长单因素试验结果如图1所示。
14600000
13.9500000
delta色谱峰保留时13.8400000间(分钟)
13.7300000(delta+gamma+alpha)色谱峰峰面积(微13.6200000伏*秒)
13.5100000
13.40
波长280nm
波长290nm
波长292nm
波长294nm
波长300nm
图1不同波长的比较
分析:
根据文献知维生素E的最大吸收波长基本均在280nm-300nm,由表中数据可见在不同波长条件下保留时间基本不变,只有色谱峰峰面积在变化,波长294nm时峰面积最大;由图知不同生育酚单体有不同的最大吸收波长,α-生育酚色谱峰的峰面积变化最明显,波长为290nm,292nm,294nm时α-生育酚的峰面积相差不大,最终选取294nm做为紫外检测器的波长。
2.1.2流动相比例单因素试验结果如图2所示。
30600000
25500000delta色谱峰保留时20400000间(分钟)
15300000(delta+gamma+alph10200000a)色谱峰峰面积(微伏*秒)5100000
00
流动相甲醇
流动相甲醇比水99比1
流动相甲醇比水98比2
流动相甲醇比水97比3图2不同流动相比例的比较
流动相甲醇比水95比5
分析:
由图知甲醇含量越高,保留时间越短,峰面积越大,即有机相比例越高,洗脱强度越大,目标物出峰时间越快。
故选取流动相比例为:
甲醇+水=98+2,甲醇+水=99+1,甲醇+水=100+0做为正交试验流动相比例的三个水平。
2.1.3流速单因素试验结果如图3所示
18700000
1660000014delta色谱峰保留时间50000012(分钟)40000010
8(delta+ga300000mma+alpha)色谱峰峰6200000面积(微伏*秒)41000002
00
流速0.8ml/min
流速0.9ml/min
图3不同流速比较流速1.0ml/min
流速1.5ml/min
分析:
由图知流速越大,保留时间越短,但峰面积反而越小。
流速加快,目标物流速1.7ml/min
在色谱柱上交换不充分,从而体现出峰面积减少。
故综合平衡选取流速为0.8ml/min,0.9ml/min,1.0ml/min做为正交试验流速的三个水平。
2.1.4柱温单因素试验结果如图4所示
16700000
14600000
12500000delta色谱峰保留时间(分钟)104000008(delta+gamma+alph3000006a)色谱峰峰面积(微200000伏*秒)4
1000002
00
柱温25摄氏度
柱温30摄氏度
图4不同柱温比较柱温35摄氏度
柱温40摄氏度
由图知,色谱柱温度越高,保留时间越短,峰面积越大,故选取柱温为35?
、柱温45摄氏度
40?
、45?
做为正交试验柱温的三个水平。
2.2正交试验结果
2.2.1因素水平表如表2所示
表2色谱条件优化因素水平表
因素
水平A流动相比例(甲醇体积)%B流速ml/minC柱温?
1980.835
2990.940
31001.045
2.2.1正交试验结果分析
2.2.1.1以峰面积为评定值的结果分析过程
色谱条件优化试验结果如表3所示:
4表3色谱条件优化试验结果L(3)9
ABC指标试验号空列流动相比例流速(δ+γ+α)色谱峰
(甲醇体积)%ml/min柱温?
峰面积(微伏*秒)
69197911(98)1(0.8)1(35)1684278688128
649938212(0.9)2(40)2630134640036
572059313(1.0)3(45)3582370577214
69614742(99)133692631694389
63402152211630755632388
52709962322535073531086
72205373(100)122718200720126
60042383233614102607262
55375893311555289554524
均值1635126.000700881.000608825.333625013.333
均值2619287.667626562.000629649.667630416.000
均值3627304.000554274.667643242.667626288.333
极差15838.333146606.33334417.3345402.667分析:
根据极差的大小,对因素的主次进行排队。
极差越大,表示该因素的水平变化对试验的影响越大,这个因素就越重要,反之,极差越小,这个因素就越不
、B、C三个因素中极差的大小,可以看出B因素即流动相重要。
比较本试验中A
比例为最重要因素,其次为C因素即流速,而A因素即柱温为不重要因素。
直观分析已大概分析出因素的主次,但还要通过方差分析进行进一步确认,方差分析表如表4所示。
表4(δ+γ+α)色谱峰峰面积方差分析表
变异来源SSdfFFαA流动相比例(甲醇体积)%376298086.88927.864
B流速ml/min32242189294.8892673.789F(2,2)=19.000.05C柱温?
180275341.556237.678
误差47852064.2222
总变异34469314787.5608分析:
由表中数据可知,B因素存在极显著差异,C因素存在显著差异,A因素不存在显著差异,即B因素、C因素为重要因素,A因素为次要因素。
对B,C两因素进行多重比较表5至表7,用LSR法。
表5峰面积多重比较用SSR及LSR值
秩次距K23
SSR0.056.096.09
0.0114.014.0
LSR0.0517198.55717198.56
0.0139536.91239536.91
表6B因素各水平均值多重比较
B因素BBB123
均值700881.000626562.000554274.667
显著性(1%)ABC
表7C因素各水平均值多重比较
C因素CCC321
均值643242.667629649.667608825.333
显著性(5%)aab
分析:
由图知多重比较结果B因素以B1最好,C因素C2和C3无显著差异则均可以,但考虑到长期用比较高的柱温可能会影响色谱柱的使用寿命,故就峰面积这一评定值来讲,最优组合为B1C2,A因素不论。
2.2.1.2以保留时间为评定值的结果分析过程
色谱条件优化试验结果如表8所示
4表8色谱条件优化试验结果L(3)9
ABC指标试验号空列流动相比例流速δ色谱峰
(甲醇体积)%ml/min柱温?
保留时间(分钟)
15.795
11(98)1(0.8)1(35)115.79715.796
13.122
212(0.9)2(40)213.14413.133
11.025
313(1.0)3(45)311.02411.024
12.630
42(99)13312.60312.617
10.529
5221110.50710.518
10.796
6232210.80810.802
10.313
73(100)12210.30710.310
10.310
8323310.31110.310
8.770
933118.7718.770均值113.31812.90812.30311.695均值211.31211.32011.50711.415均值39.79710.19910.61711.317极差3.5212.7091.6860.378分析:
比较本试验中A、B、C三个因素中极差的大小,可以看出A因素即流动相比例为最重要因素,其次为B因素即流速,而C因素即柱温为不重要因素。
通过方差分析进行进一步确认,方差分析表如表9所示。
表9(δ+γ+α)色谱峰保留时间方差分析表
变异来源SSdfFFα
A流动相比例(甲醇体积)%18.716281.374
B流速ml/min11.116248.33F(2,2)=19.000.05C柱温?
4.265218.543
误差0.2302
总变异34.3308
分析:
由表中数据可知,A因素存在极显著差异,B因素存在显著差异,C因素
不存在显著差异,即A因素、B因素为重要因素,C因素为次要因素。
对A,B两因素进行多重比较表10至表12,用LSR法。
表10保留时间多重比较用SSR及LSR值
秩次距K23
SSR0.056.096.09
0.0114.014.0
LSR0.051.1921.192
0.012.7412.741
表11A因素各水平均值多重比较
A因素AAA123
均值13.31811.3129.797
显著性(5%)aabb
表12B因素各水平均值多重比较
B因素BBB123
均值12.90811.32010.199
显著性(5%)abb
分析:
因为此方差分析表以保留时间为评定值,故保留时间越短越好。
由图知多重比较结果A因素以A3最好,而B因素B和B3无显著差异均可以,最后综合2
2.2.1.1和2.2.1.2的结果,最优组合为A3B2C2即流动相为甲醇,流速为0.9ml/min,柱温为40?
。
3本章小结
本章通过对检测波长、流动相比例、流速、柱温做单因素试验,然后选取合适的水平做正交试验以研究出最佳色谱条件,结果表明:
检测波长为294nm,流动相为甲醇,流速为0.9ml/min,柱温为40?
为最佳色谱条件。
第三章标准溶液的绘制
引言外标法也称为标准曲线法,是所有定量分析中最通用的一种方法。
因为相对比较简单,是实际工作中应用最多的一种定量分析方法。
测定方法为:
把待测组分的纯物质配制成不同浓度递增的标准系列,在一定操作条件下向色谱柱中注入相同体积的标准样品,测得各峰的峰面积或者峰高,绘制A-C或H-C的标准曲线,然后在完全相同的条件下注入相同体积的待测样品,根据所得的峰面积或者峰高从曲线上查的含量。
本试验是选取峰面积和浓度绘制标准曲线。
在使用标准曲线定量时,应注意待测样品的浓度要在标准系列的浓度范围之内,这样才能获得准确的分析结果,本试验参考文献中测得的各种食用植物油的维生素E含量,确定标准曲线的线性范围为1.0mg/ml,140mg/ml。
当待测物质含有几种成分时,而标准溶液为几种成分的混合溶液,应先确定每种成分的保留时间,确定每种成分的出峰顺序进而确定是哪种成分。
即先注入一定浓度的单一成分的标准溶液,然后再注入混合标准溶液。
1材料与方法
1.1仪器与设备
紫外可见分光光度计UV-5200上海元析仪器有限公司
Waters高效液相色谱仪e2695带2489紫外检测器美国沃特斯有限公司1.2方法
1.1.1标准溶液浓度的标定
取维生素E标准溶液三种组分的1mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml标准溶液各100ul,用无水乙醇分别稀释定容至5ml。
按《NY/T1598-2008食用植物油中维生素E组分和含量的测定高效液相色谱法》给定的波长和比吸光系数,用紫外分光光度计测定各种形态维生素E的吸光度值。
1.1.2仪器色谱条件
紫外检测器波长为294nm,流动相为甲醇,流速0.9ml/min,柱温40?
,进样量10ul。
1.1.3标准曲线的绘制
取40ug/mlδ-生育酚,α-生育酚,γ-生育酚单一成分的标准溶液进样,确定单一成分的保留时间。
然后进样1mg/ml、10mg/ml,40ug/ml,60mg/ml,100mg/ml,140mg/ml的浓度梯度的混合标准溶液,得到各成分的回归方程。
1.1.4精密度试验
取40ug/ml维生素E标准溶液连续进样6次,并计算出浓度。
2结果与分析
2.1标准溶液的准确浓度
计算得δ-生育酚、α-生育酚、γ-生育酚的准确浓度分别为:
0.9814mg/ml,1.0282mg/ml,0.51185mg/ml。
2.2标准曲线
2.2.1单一成分的色谱图如图5。
δ-生育酚γ-生育酚α-生育酚
图5三种成分的图谱
2.2.2混合标准溶液的色谱图如图6所示
图640ug/ml混合标准溶液的谱图
分析:
由图知γ-生育酚的响应值最大,其次是δ-生育酚,且γ-生育酚和δ-生育酚响应值差别很小,最小的是α-生育酚;δ-生育酚色谱峰的保留时间最短
生育酚,最后是α-生育酚。
即最先出峰,其次是γ-
2.2.3标准溶液的线性关系
三种成分的回归方程如表13所示。
表13维生素E中各种生育酚标样的回归方程
维生素E标准曲线R
33δ-生育酚Y=5.26×10X+2.63×100.9985
33γ-生育酚Y=5.81×10X+6.92×100.9984
33α-生育酚Y=3.85×10
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