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分子生物学研究方法
分子生物学研究方法(上)
——基因操作技术
主要内容
一、基因操作
二、克隆载体
三、基因文库与筛选
四、克隆DNA的鉴定
五、PCR技术
一、基因操作
1.DNA克隆概述
2.质粒DNA的制备
3.限制酶与电泳
4.连接、转化与重组体的分析
1.DNA克隆概述
★克隆(clone)的含义
1)在多细胞的高等生物个体水平上,克隆表示由具有相同基因型的同一
物种的两个或数个个体组成的群体。
所以,从同一受精卵分裂而来的
单卵双生子(monozygotictwins)便属于同一克隆
2)在细胞水平上,克隆表示由同一祖细胞(progenitorcell)分裂而来
的一群遗传上同一的子细胞群体。
3)在分子生物学上,人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DN中,
使之得以永久保存和复制,这种过程称为克隆。
1.1DNA克隆
任何DNA片段都能通过先插入到一段可以自我复制的DNA即载上,
形成通常可以在另一宿主(细菌或酵母)中进行复制的重组DNA,然后
在细菌或酵母细胞中生长而扩增百万倍以上。
这种由单一DNA片段复制成许多相同DNA片段的过程称为DNA克隆
这是分离目的基因的有效方法
1.2宿主和载体
□DNA克隆的重要环节是把一个外源DNA导入生物体细胞,并使它得到扩增。
□外源DNA片段很难进入受体细胞(宿主),即使进入细胞,一般也不能进行
复制和功能表达。
——因为,所得到的外源DNA片段一般不带有复制子系统及在新的受体细胞
中进行功能表达的调控系统。
□载体:
携带外源DNA进入受体细胞的工具,其本质为DNA
□载体的特征和基本要求
1)在宿主细胞中能独立自主的复制,即本质是复制子
2)容易从宿主细胞中分离纯化,应包含1-2个选择标记,赋予宿主细胞新的特性,便于重组子的筛选。
即必须具备一个能使含有该载体的宿主可以从那些不含该载体的细胞中被筛选的基因。
一般是赋予宿主对某种毒素的抗性,或使宿主细胞在特定生长条件下生存。
3)载体DNA分子有一段不影响他们扩增的非必需区域,插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。
4)分子量小,多拷贝,易于操作。
5)包含多种限制性酶的的单一切点,在切点内可与外源DNA重组。
□载体的种类
1)质粒(plasmid)
主要指人工构建的质粒。
克隆的最大外源片段为10kb
2)噬菌体(phage)
λ噬菌体可用来克隆较大的DNA片段,克隆的最大外源片段为23kb;
M13噬菌体可以使克隆DNA以单链形式被提取出来。
3)粘粒(cosmid,柯斯质粒)
即质粒-λ噬菌体的杂合体,兼有两者特性的形式。
克隆的最大外源片段为45kb。
4)细菌人工染色体(BAC)
克隆的最大外源片段为300-350kb
5)酵母人工染色体(YAC)
克隆的最大外源片段为1000kb
1.3亚克隆
概念:
将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体的转移过程。
主要用来对较大的克隆片段上较短区段进行仔细研究,或是将基因转移到能在特定物种中表达的另一载体上。
□亚克隆的程序(以大肠杆菌的质粒载体为例)
1)含有目标克隆序列的质粒DNA的提取
2)用限制酶将质粒酶切成不连续的片段
3)经琼脂糖凝胶电泳分离片段
4)纯化目的片段
5)将目标片段连接在一新质粒载体上,形成新的重组分子
6)将连接的质粒转入某一大肠杆菌菌株(转化)
7)转化细菌的筛选
8)重组质粒得分析
1.4DNA文库(基因文库)
用于鉴定未知基因的克隆试验的DNA有两个来源
1)目的物种的基因组DNA,用于构建基因组文库
2)真核生物特定基因表达细胞或组织的mRNA群体,用于构建cDNA文库
□DNA文库概念:
是某一生物体全部或部分基因的集合。
或指由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。
□DNA文库包括:
1)基因组文库:
指汇集某一基因组所有DNA序列的重组体DNA群体。
效率低,不适用真核基因组
2)cDNA文库:
用来自表达目的基因细胞或组织的mRNA作为来源构建的文库
效率高,适合真核生物;科龙的仅是外显子,无内含子。
□将某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当载体在体外重组后,转化宿主细胞,所得的菌落或噬菌体的集合即为基因组DNA或cDNA文库
1.5基因文库的筛选
指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。
主要方法:
核酸杂交法,PCR筛选法和免疫筛选法等
1.6克隆分析
当含有目的基因的克隆被确定后,通过限制酶酶切图谱来分析DNA片段,进一步研究克隆片段的结构,以至于对全长片段进行测定
2.质粒DNA的制备
2.1质粒载体
细菌质粒是独立于宿主基因组复制、编码抗生素抗性基因的小型环状DNA分子,运载克隆DNA的常用载体
1)大小约2-200kb,以多拷贝形式存在于宿主大肠杆菌中,每个细胞达500-700个
2)质粒的正常组分依赖于宿主细胞中的聚合酶及其他成分,但质粒含有复制起点,用以保证质粒的自主复制
3)质粒一般仅有几个基因,其中包括抗生素抗性基因,
如:
ampr基因:
氨苄青霉素抗性基因,编码β-内酰胺酶,降解氨苄青霉素
tetA基因:
四环素抗性基因
2.2质粒的小量制备
仅从几毫升培养液中提取小量质粒用作分析,这一过程被称为小量制备。
通常用碱裂解法
3限制酶与电泳
3.1限制性核酸内切酶
□细菌的限制修饰系统
1)限制酶:
识别一小段对称的DNA序列,在识别位点处切割双链DNA,外源DNA被降解。
2)修饰酶(甲基化酶):
对细胞内DNA的相应识别序列内的C或A甲基化,保护宿主细胞内DNA不被降解。
□回文序列:
DNA双链中均按5’→3’方向读,其序列相同。
3.2限制性酶解
3.3琼脂糖凝胶电泳
□琼脂糖是从海藻中提取的一种多糖
凝胶浓度(%,W/V)分离的DNA片断大小
0.31kbp~50kbp
0.71kbp~20kbp
1.4300bp~6kbp
□电泳过程可用来分离大小不同的DNA片断
移动方向:
负极→正极
移动速度:
与DNA片断大小和形状有关
环状DNA的移动速度﹥线性DNA
小片段DNA的移动速度﹥大片段DNA
□电泳步骤:
制备凝胶(加溴化乙锭,EB,指示电泳进程);
点样;打开电源。
4.2转化
□概念:
用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞易于吸收外源DNA,这一过程称为转化
或:
宿主细胞直接吸收外源DNA分子,并获得某种新的遗传性状的过程
□感受态细胞:
用Ca2+预处理过的细胞
□对宿主菌的要求:
1)应是限制系统缺陷型,即缺少限制酶基因,不能降解重组体;
2)同源重组缺陷型,阻止可能发生的克隆片段的重排现象
4.3筛选转化子
确定哪些克隆中含有插入目的片段的重组质粒
4.4转化子的保存
在甘油溶液中冻存,保护细胞免遭冰晶形成的伤害
4.5凝胶分析
将酶切后的片段分开,建立酶切图谱
□载体
U:
上,显示切口构型的条带
下,显示超螺旋构型的条带
E:
在E位点切割后的线性质粒
□重组体AorB:
U:
上,表示切口构型的重组体AorB条带
下,显示超螺旋构型的重组体AorB条带
E:
上,表示被EcoRⅠ切后不含X的片段
下,表示被EcoRⅠ切后含X的片段
H/S:
A:
上,H-E-X-S(逆时针);下,S-E-H片段
B:
上,H-E-S(逆时针);下,S-X-E-H片段
二、克隆载体
1.质粒载体的设计
2.噬菌体载体
3.粘粒、YAC与BAC
4.真核生物载体
1.2蓝-白筛选
□可在同一个平板上完成筛选,其中也涉及基因的插入失活,他利用一种蓝色
化合物的形成作为指示剂。
□失活基因为lacZ,他编码β-半乳糖苷酶,受lac启动子的调控。
当E.Coli菌株
表达Lac阻抑物,则载体的lacZ基因由异丙基—β—D—硫代半乳糖苷
(IPTG,一种诱导物)诱导表达,表达形成的酶可以利用底物5—溴—4—氯—
3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)形成一种蓝色化合物
β-半乳糖苷酶
X-gal——————→蓝色化合物
□重组质粒中lacZ的插入失活导致它不能表达β—半乳糖苷酶,不能形成蓝色
菌落(为无色菌落)
□改进
上述方法所用的载体都有一个lacZ截短后的衍生物lacZ’,此基因编码
β-半乳糖苷酶的N-端的α-肽。
这种载体须转入一种含有表达β-半乳糖苷酶
的C端部分的突变基因的宿主菌,表达的β-半乳糖苷酶的C端能与α-肽互补
产生有活性的酶
□优点:
缩短了质粒所载基因的长度,但又没有改变该法的原理
□基因内互补作用:
指2个彼此互补的突变基因,他们编码产生的失活的多肽产物,能结合形成一种由功能活性的蛋白质分子,而使个体呈现正常的野生型表型的生命现象。
1.3多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)
pUC系列质粒,包含一个改造过的lacZ’基因,在该基因的编码区的第一部分由多个限制酶酶切位点,这一区域称为多克隆位点。
□目的DNA插入mcs中任一个或任两个位点之间,都会使LACz’基因失活,并在适宜的平板上产生白色菌落。
□MCS使在选择用于克隆的限制酶时具有一定的灵活性。
2.噬菌体载体
2.1λ噬菌体
□生活史
λ(线性DNA)→宿主细胞→
裂解途径:
环化→DNA被复制组装成颗粒→细胞死亡
溶原途径:
将DNA整合到宿主基因组
□λ基因组为48.5kb(线性双链DNA),其末端有由12bp的粘性末端构成的COS位点
COS位点:
由粘性末端结合形成的双链区域。
COS位点不对称,但具有16bp的限制酶位点,可导致DNA在细胞内自身环化。
□基因组中心区域的大部分对侵染裂解都是不必要的,可被不相关的DNA序列所替换,但对插入的DNA大小有限制。
即DNA的总长度必须是原长的75%—105%之间,即37-52kb。
考虑到必要区域,可克隆进的DNA片段大小约为20kb(最大为23kb)
□要求
1)不含插入片段(即左右臂直接连接)的末端连接物,或远远小于或远远大于最佳长度20kb的插入片段的连接物对包装物都是过小或过大,不能被包装。
2)同时含有两条左臂或两条右臂的重组体也不能生存。
□注意几个概念的区别
1)转化:
宿主细胞直接吸收外源DNA分子的过程;或将质粒等外源DNA制剂引入细胞的过程(将重组DNA导入原核细胞的过程)(一般指细菌)
2)侵染(感染):
一般指天然λ噬菌体进入细菌的过程
3)转染:
重组λ噬菌体DNA或重组粘粒载体DNA分子直接转化(进入细菌)受体细胞的过程。
(或寄主细胞捕获噬菌体DNA的过程)
但转染效率低。
(一般指动物细胞)
4)转导:
在体外将重组DNA包装成完整的λ颗粒,利用噬菌体的自然机理将外源DNA注入宿主细胞的过程(以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程)
2.2噬菌斑的形成
3.粘粒、YAC与BAC
3.1粘粒载体(cosmid,柯斯质粒)
□是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
最初是为克隆和增值基因组DNA的大片段而设计的。
□特点:
兼具有λ噬菌体的高效感染能力和质粒易于克隆、选择的优点。
既能像质粒一样在寄主细胞内复制,也能像λDNA一样被包装到噬菌体颗粒中去。
□用粘粒载体进行克隆时有两个缺点:
1)两个或多个粘粒分子之间的重组,即自我重组,减低了阳性重组率。
2)两个或多个外源DNA片段同时插入,使最初在真核染色体DNA上本来
不相连的片段连接起来。
3.1.2粘粒的改进
主要是防止载体的多个拷贝或目的DNA的多个拷贝进入某个重组体。
如C2XB
1)含有两个cos位点
2)两个cos位点之间有一个产生平末端的限制酶(SmaⅠ)位点
用C2XB的克隆过程
□载体用BamHⅠ和SmaⅠ酶切。
□目的DNA用碱性磷酸酶处理。
□在所定条件下SmaⅠ的平末端连接不能有效进行,最终能包装的产物只是图中所示的产物。
3.2YAC载体(酵母人工染色体)
□它由大肠杆菌质粒和酵母DNA片段组成,是在酵母细胞中克隆外源DNA大片段的克隆体系。
□YAC由酵母染色体中分离出来的DNA复制起始序列(ARS)、着丝粒(CEN)、端粒(TEL)及酵母选择标记,再组合到大肠杆菌质粒上形成。
□由于YAC载体以质粒形式出现,因此,有时写作pYAC
3.2.1YAC具有真核染色体的几个关键部位
1)着丝粒(CEN):
主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中去
2)端粒(TEL):
对于染色体末端的复制及防止染色体被核酸酶切断具有重要
意义
3)自主复制序列(ARS):
即在染色体上有多处DNA复制起始的位点,与质粒
的复制起始位点有些相似。
□YAC可容纳大于Mb(最大为1000kb)的基因组DNA片段
3.2.2YAC载体的特点
1)可在大肠杆菌中克隆,具有较高的拷贝数,这样可使外源基因在转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增
2)含有在酵母中便于选择的遗传标记
3)含有合适的限制酶位点,以便于外源基因的插入
□pYAC3所携带的酵母序列
1)TEL:
端粒,该片段可被酵母中的端粒酶延伸
2)CEN4:
酵母4号染色体的着丝粒序列。
不同的是,即使着丝粒紧邻于人工染色体的一端,它也可以正确的分离子染色体。
3)ARS:
自主复制序列,酵母的复制起点。
4)TRP1和URA3(尿嘧啶):
酵母选择性标记分别位于两端,以确保只有正确重组的YAC才能在酵母细胞中生存。
(宿主细胞为Trp和Ura的营养缺陷性)
5)SUP4:
在重组体中行使插入失活功能。
是一个相关于红-白颜色测试的基因,类似于大肠杆菌中的蓝-白筛选。
当外源DNA插入SUP4中,该基因被破坏,受体细胞形成红色菌落。
3.2.3用酿酒酵母的筛选
1)酵母选择性标记并不像大肠杆菌的质粒那样能赋以对毒性物质产生抗性,而是能使酵母在缺乏某种特定养分的选择培养基中生长。
2)原理:
□营养缺陷性酵母突变株不能产生某种特定的化合物,如TRP1突变株,不能合成Trp,只有在添加了Trp的培养基中才能生长。
□携带有完整的TRP1基因的YAC(或其他载体)突变酵母株可互补这一缺陷,结果只有被转染的细胞才能在缺乏Trp的培养基上生长。
3.2BAC载体(细菌人工染色体)
是以细菌F因子(细菌的性质粒)为基础组建的细菌克隆体系
他编码自己的DNA聚合酶,在细胞中仅有1或2个拷贝数。
能容纳300—350kb的插入片段
□BAC的优点:
1)稳定,容易转化:
YAC虽然容纳非常大的片段,但这些片段经常形成非邻近片段,
在增值中会丢失部分DNA(不稳定)
2)BAC在大肠杆菌宿主中生长迅速,应用标准小量制备技术纯化
也较简单,即比YAC易分离。
3)具有特殊切割位点,能确保克隆能在载体区域内线性化,而不需要
在插入片段内进行酶切。
□BAC比YAC更受使用者的青睐,现已广泛应用于基因组作图计划
4.真核生物载体
将DNA转入真核生物(转染)比转化细菌困难得多,同时转染的效率也低得多。
4.1转染真核生物的途径
1)转染酵母及植物细胞
植物细胞(酵母细胞)——→降解细胞壁→产生脆性原生质体植物细胞或酵母细胞易吸收DNA
2)转染动物细胞
外源DNA+Ca3(PO4)2→沉淀于细胞表面→被动物细胞低效率吸收
3)电穿孔:
把宿主细胞置于一个高压电场中,通过电场脉冲在细胞膜(细胞壁)上打开临时的孔道,DNA分子随即进入细胞,该过程称为电穿孔。
打开的孔道在随后的过程中利用宿主细胞的酶修复系统将之修复。
4)显微注射法:
用极细的玻璃毛细管等显微注射装置将DNA直接注入到培养基中的单个动物或植物细胞的细胞质甚至细胞核中。
5)基因枪法(也称为颗粒轰击技术)
将DNA包装在金或钨的微粒中,然后用基因枪将DNA包被的颗粒打入靶细胞。
4.2穿梭载体
既能在细菌宿主中复制和扩增,有能在真核宿主细胞中复制和表达的载体,同时含有原核和真核载体的复制起始点和选择性标记,可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体,很容易从一宿主转导另一宿主,即来回穿梭。
4.3根癌农杆菌Ti质粒
□植物基因克隆的载体
□Ti质粒存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中,这种肿瘤的形成是由
Ti质粒决定的,故称为诱导肿瘤的质粒,简称Ti质粒。
□图中T-DNA为转移DNA,是Ti质粒最重要的组成部分。
在土壤农杆菌感染
植物细胞后,Ti质粒中的T-DNA能随机地共价整合到染色体DNA中,结果在T-DNA基因指导下造成植物细胞失控生长,形成冠瘿瘤或根瘤。
□T-DNA所携带基因的主要功能
1)决定肿瘤的形成和形态
2)控制冠瘿碱的合成。
这也是Ti质粒的主要功能,说明T-DNA是Ti质粒的核心区段。
□应用:
Ti质粒的T-DNA+目的基因→重组Ti质粒→整合到植物DNA→表达
Ti质粒很大,很难对其操作,做如下改良:
1)T-DNA和Ti质粒的其余部分若在同一细菌细胞的不同分子上可以发生整合
因此可在标准的大肠杆菌质粒上构建重组的T-DNA,然后转化到根癌农杆菌细胞中。
该农杆菌携带有不含T-DNA的、改造过的Ti质粒。
2)T-DNA包含致癌基因,可引起植物下拨生长紊乱,因此将T-DNA中的冠瘿
瘤形成的基因删除,即所谓的卸甲T-DNA
4.4杆状病毒
杆状病毒侵染昆虫细胞
□病毒基因组编码的主要蛋白之一是在感染细胞核内大量聚集多角体蛋白,
因为该基因有一个极强的启动子。
□利用该启动子可以驱动重组进杆状病毒基因组的外源基因的过量表达,从而用被感染的昆虫细胞来大量生产目的蛋白。
这些蛋白质是翻译后修饰的动物蛋白,而细菌表达系统作不到这一点。
外源DNA+杆状病毒基因组→重组DNA→包装→感染昆虫细胞
→表达大量蛋白
4.5哺乳动物病毒载体
1)SV40(猿猴空泡病毒40)
该病毒可感染多种哺乳动物
基因组只有5.2kb,经历着类似于λ噬菌体的包装限制,因此不能用来转移大片段。
2)反转录病毒
有强启动子,可用作基因治疗中的载体,同时外源DNA也能以稳定的方式整合进宿主基因组。
4.6直接基因转移
不用特殊的真核载体,也可以直接将基因导入植物或动物培养细胞。
携带有真核基因的细菌质粒可以暂时保留在细胞中而不复制,也可以低效重组整合进宿主基因组。
三、基因文库与筛选
基因(组DNA)文库:
是某一生物体全部或部分基因的集合。
将某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当载体在体外重组后,转化宿主细胞,所得到的菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因组DNA或cDNA文库。
□基因文库的种类
1)基因组文库:
由基因组DNA所制成的文库
2)cDNA文库:
由cDNA制成的文库
□基因文库的要求
为保证能从基因组文库中筛选到某个特定基因,基因组文库必须具有一定的代表性和随机性。
即文库中全部克隆所携带的DNA片段必须覆盖整个基因组。
□提高文库代表性的策略
1)用机械切割法或限制酶切割法随即断裂DNA,以保证克隆的随机性
2)增加文库重组克隆的数目,以提高覆盖基因组的倍数
□预测一个完整基因组文库应包含的克隆数目,可用Clark和Carbon于
1975年提出的公式:
N=ln(1-p)/ln(1-f)
N:
表示一个基因文库所应该包含的重组克隆数目;
p:
表示所期望的靶基因在文库中出现的频率;
f:
表示重组克隆平均插入片段的长度和基因组DNA总长的比值。
例子:
给定概率为0.99,插入片段大小为20kb的情况下,所需重组体的数目对于大肠杆菌基因组(4.6×106bp)和人类基因组(3×109bp)分别为:
大肠杆菌:
N=1.1×103
人类:
N=6.9×105
□由上例可知:
构成完整基因文库所需重组子的数目取决于
1)基因组大小
2)目的基因片段的大小
3)所选载体的容量,原则是尽量减少重组子数目
因此对于大肠杆菌,如选用噬菌体载体即可;对于人类基因组DNA来说,选用噬菌体载体就需6.9×105个重组体,数目太大,因此只有插入大片段才能减少重组体数目,因此只能用大容量的载体。
2.cDNA文库的构建
步骤:
1)cDNA的合成
2)与载体连接
3)体外包装
4)转化大肠杆菌
5)挑取噬菌斑
cDNA的合成
3基因文库的筛选
□筛选:
指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。
□筛选的方法:
主要有:
核酸杂交法;PCR筛选法;免疫筛选法等。
3.2PCR筛选法
□前提条件:
已知足够的序列信息并获得基因特异性引物
□特点:
操作简单
□过程
1)将整个文库(以质粒的形式或细菌的形式均可)保存在多孔培养板上;
2)用目的基因探针对每个孔进行PCR筛选,鉴定出阳性的孔;
3)将每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板进行PCR筛选;
4)重复以上程序,直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。
3.3免疫筛选法
□原理:
抗原抗体特异性结合
□适用于对表达文库的筛选。
即DNA文库或cDNA文库是
用表达载体构建的,每个
克隆都可在宿主菌中表达,
产生一条多肽。
□适用条件:
靶基因序列未知
但有针对该基因产物的特异性
抗体即可用此法。
□过程与菌落或噬菌斑杂交相似
四、克隆的鉴定
□克隆的鉴定过程包括测定重组DNA分子的各种特性:
如大小、限制酶图谱、基因的方向及核苷酸序列等
□在克隆鉴定前必须纯的已克隆化的DNA样品
1)质粒DNA(重组体)的制备。
(按提取质粒DNA的方法进行)
2)噬菌体颗粒DNA(重组体)的制备
从噬菌斑经纯化的噬菌体感染细菌——从裂解液中移去细胞残骸——离心或
用聚乙二醇(PEG)沉淀细胞,回收噬菌体颗粒————经苯酚-氯仿抽提、
乙醇沉淀——DNA——保存在TE缓冲液中
(TE缓冲液:
10mmol/LTris.HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0)
1.限制酶图谱(restrictionmap)
□概念:
同一DNA用不同的限制酶进行切割,从而获得各种限制酶的切割位点,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。
由此建立的位点图谱有助于对DNA的结构进行分析。
□可采用单酶切、双酶切、多酶切、部分酶解等方法
五、PCR技术
1.PCR
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)
是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,既无细胞分子克隆技术。
□由Mullis于1985年发明
□PCR也称体外酶促基因扩增,其基本原理是根据DNA的半保留复制,在体外进行DNA得变性、复性和延伸。
靶DNA分子变性后解链,两条单链
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- 分子生物学 研究 方法