流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术.docx
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流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术
流感病毒RNA荧光RT(PCR检测技术)-
流感病毒核糖核酸荧光逆转录聚合酶链反应检测技术
实时荧光定量聚合酶链反应是在常规聚合酶链反应基础上发展起来的定量聚合酶链反应技术。
通过在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,对整个聚合酶链式反应过程进行实时监控。
最后,根据ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析。
常用的实时荧光定量PCR可分为非特异性荧光标记的SYBRGreen法、特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。
1。
实时荧光定量聚合酶链反应原理:
1。
SYBRGreen方法:
SYBRGreen是一种双链DNA结合染料,在自由状态下不发光,当无意中掺入双链DNA时会发出荧光信号。
它的强度与双链DNA的数量有关。
随着扩增产物数量的增加,检测到的荧光信号增加。
2,TaqMan方法:
在扩增反应液中加入特异性探针,探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团,当探针完成时,两个基团的位置接近,5’端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收,此时未检测到荧光信号,在扩增过程中,探针与模板结合形成5’→3’切除活性底物当Taq酶沿着模板向前延伸到探针连接处时,发生链置换。
Taq酶的5’→3’切除活性切割从探针上切割连接到探针5’端的报道基团。
5’末端报道基团的荧光能量与3’末端荧光淬灭基团的吸收分离,并且可以检测荧光信号。
在每个聚合酶链反应循环之后,荧光信号也有一个同步生长过程,就像扩增产物一样3.分子信标法:
将
探针设计成发夹形的茎环。
环的核苷酸序列与扩增产物的序列互补。
两端的核苷酸序列互补形成茎。
一端用报道基团标记,另一端用淬灭基团标记。
当探针不与模板结合时,报道基团和淬灭基团在空间上彼此靠近,报道基团的荧光能量被淬灭基团吸收。
此时,无法检测到荧光信号。
与模板结合后,探针的构象由发夹状变为链状,报道基团和淬灭基团分离,并呈荧光
核酸检测是鉴定流感病毒基因组的一种强有力的方法,即使基因组含量很低或可以检测到死病毒。
本章将介绍聚合酶链反应检测流感病毒
流感病毒基因组为负链核糖核酸。
与病毒核糖核酸互补的脱氧核糖核酸必须在聚合酶链反应扩增之前合成,即cDNA逆转录酶是一种用于合成cDNA的聚合酶。
因此,扩增流感病毒基因组的过程被称为逆转录聚合酶链反应。
逆转录聚合酶链反应需要一对类型特异性引物、四个脱氧核苷酸、核糖核酸模板、逆转录酶和脱氧核糖核酸聚合酶。
首先,用逆转录酶将病毒核糖核酸反转录成cDNA,然后进行聚合酶链式反应25-30个循环,使DNA产物加倍
2、试剂设备和仪器
咽拭子液制备:
一瓶MEM液500毫升,+8万单位GM1.25ml毫升,分装成5ml小管,每管4毫升管状压力最好
1,核糖核酸提取试剂盒荧光聚合酶链反应检测试剂盒
提取试剂盒成分:
洗脱缓冲液,载体核糖核酸,裂解/结合增强,裂解/结合溶液结合溶胶,核糖核酸结合珠,洗液1,洗液2
荧光聚合酶链反应检测试剂盒成分:
2×逆转录聚合酶链反应反应液(2×逆转录聚合酶链反应缓冲液),25×逆转录聚合酶链反应酶混合物(25×逆转录聚合酶链反应酶混合物),高G/C含量引物/探针检测增强剂,核酸降解酶生物安全柜移液器微型离心机微型涡旋混合器微型离心管聚合酶链反应管冷冻箱带过滤咀低温冰箱U形样品处理板96孔磁性板3,操作步骤
1。
样品处理(在样品处理区)
根据咽拭子样品数计算待制备的裂解物和磁珠混合物的量,即待测样品数+阴性对照+A对照+B对照+一个样品量为损失唯一要准备的液体是洗液:
洗液1:
向洗液浓缩液中加入12毫升无水异丙醇(100%)。
1瓶摇匀,室温保存。
洗液2:
向洗液浓缩液2瓶中加入32毫升无水乙醇(100%)摇匀,室温保存。
摇动含拭子的运输溶液2分钟,取50微升上清液用于核酸提取。
剩余的溶液储存在-80℃
1。
每次反应制备
±1微升载体核糖核酸的裂解/结合溶液,每次反应制备65微升裂解/结合溶液,每次反应制备65微升无水异丙醇摇匀,室温保存,以备后用
2。
磁珠混合物的制备每反应
10微升裂解/结合增强,每反应10微升核糖核酸结合珠混合均匀,4℃保存备用3.分裂/结合
U形板按顺序加入XXXX发行的引物探针:
引物/探针名称每管外径数和每管总摩尔数(nmol)稀释至100μM储存溶液加无核糖核酸酶水体积(μl)p-正向核糖核酸序列-反向核糖核酸序列-探针核酸序列A-M-F30核酸序列a-M-R264H1F1147H1R1673H1HA-F768H1HA-R1094SWH1F786SWH1R920222222222229.18.38.38.78.7678.78.78.36.710.5108.710.810.810.810.8
3。
反应体系的制备:
从
试剂盒中取出所需试剂,在室温下熔化,以4000转/分钟的速度离心30s。
反应体系的制备:
核糖核酸酶游离水5μl
2×逆转录-聚合酶链反应缓冲液12.5μl上游引物0.5μl下游引物0.5μl探针0.5μl探针0.5μl25×逆转录-聚合酶链反应酶混合液:
1μl
每次反应,充分混合均匀,每支聚合酶链反应管20微升(专用于指定仪器)并转移至样品处理
3。
从样品添加(样品处理区)中回收的阳性核糖核酸应储存在-20℃并稀释5倍以供使用。
向每套聚合酶链反应试管(专用于指定仪器)中分别加入提取的样品核酸溶液和阴性及阳性对照5ul。
将试管盖紧后,以4000转/分钟的速度离心30s4.荧光逆转录-聚合酶链反应(在检测区)
1。
将含有反应体系和样品核糖核酸的聚合酶链反应反应管放入荧光聚合酶链反应检测器2中。
将循环条件设置为
a)_50_℃30__min
b)_95_℃10__minc)_95_℃15__Sec
d)_55_℃31__Sec(注意:
荧光收集在此步骤中设置)从步骤c(_95_℃15__Sec)-44__cycle
5开始循环。
结果是
1。
结果分析条件为256±199。
反应完成后,自动保存测试数据文件,将噪声基线调整到刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点,并读出结果。
2.结果描述和判定原则
用于在质控标准有效的情况下判定结果:
阴性质控的检测结果为阴性;阳性对照组的Ct值为
≤28.0否则,这个实验将被视为无效。
根据Ct值的判断结果,无Ct值的样本为阴性样本Ct值≤40.0的样本为阳性样本;建议重做Ct值大于37.0的样品如果重做结果中没有值,则为负,否则为正。
6.输入一个新程序:
生成程序文件该程序文件包含一个控制热循环仪操作参数的程序,并定制Opticon2检测器何时测量指定样品、定量标准和空白孔中的荧光。
程序的步骤可以在程序文件窗口中输入和编辑,每个步骤都有一个列表和图表。
按下主文件的协议设置部分中的新建按钮,生成新的程序文件。
选择温度和热封面控制模式单击温度和热封面模式列中的设置模式按钮,显示热
封面模式窗口。
您可以自定义操作过程中使用的温度控制方法和盖子控制方法。
温度控制方法DNA引擎Opticon2可以通过两种不同的方式控制模块的温度,每种方式都会影响样品加热的速度和准确性。
1,计算控制是默认的温度控制方法这是大多数程序选择的方法。
它是一致的、快速的和可靠的。
当使用计算控制方法时,DNA引擎Opticon2根据模板的温度、样本管的传热速度和样本的体积来估计样本的温度因为这种估计是基于已知量和热传导的规则,所以样品温度控制比模块温度控制方法更精确。
使用计算控制方式可以明显缩短程序的运行时间。
此外,保持酶活性和减少引物错配也是有益的。
在计算控制模式下,变性时间通常为5-30秒,并且复性和延伸温度也可以降低,但是时间长度随反应而变化。
计算控制方法通过以下三个方面缩短了程序:
?
8?
5快速增加样品温度
?
8?
5根据样品确定保持时间
,而不是模块达到目标温度的时间?
8?
5仪器根据容器的型号和反应溶液的体积自动补偿
2。
在模块控制模式下,DNA引擎Opticon2系统根据程序控制模块的温度,而不是样品的温度。
在控制样品的实际温度时,模块控制方法的精度比计算控制方法差。
在模块控制模式下,样品温度总是低于模块温度。
滞后时间的长度与容器的类型和反应溶液的体积有关,通常在10-30秒之间。
模块控制模式通常用于运行从其他模块控制模式的热循环仪获得的程序,例如MJ研究公司的PTC-100循环仪和PTC-150循环仪。
热罩控制着当样品被加热时,水蒸气将向上蒸发并积聚在管罩或平板罩上这将导致样品体积、反应物浓度和酶促反应动力学的变化通过使用热盖,反应容器上部的温度可以高于反应液体的温度,从而减少水的蒸发。
DNA引擎Opticon2系统有三种方法来控制热罩:
恒定(恒定
)、跟踪或关闭
?
8?
5恒定:
保持隔热罩的特定温度要使用恒定热罩温度控制方法,您可以选择恒定,然后输入30到110度之间的温度,或者用箭头滚动到所需温度。
一般建议比程序中的最高温度高5-15度。
您还可以设置样品模块温度,低于该温度时,热盖将关闭。
在盖关闭温度中输入1至50度的温度,或用箭头滚动至所需温度。
?
8?
5跟踪:
将热盖的温度设置为略高于样品模块的温度。
这种方法对于30至70度之间的长期保温过程是有用的,因此没有必要一直将热罩的温度保持在较高的温度。
一般设置比模块温度高5度。
要使用恒定跟踪温度控制方法,您可以选择跟踪,并在柱盖温度=块温度+(热盖温度=模块温度+)中输入1度到45度之间的温度,以便热盖温度保持高于模块温度。
定制样品-当模板的温度低于一定温度时,热盖会自动关闭。
您可以在“关闭盖子”中输入1到50度之间的温度,或者用鼠标箭头滚动选择。
注:
由于热盖没有冷却能力,当模块温度快速变化时,热盖的温度变化无法跟上模块。
由于热罩质量大,其加热速度比模块慢。
?
8?
5关闭:
热盖没有电源。
在这种模式下,样品将以与隔热层温度和用于管或板的密封剂类型相关的速率进行浓缩。
该选项只能在用油或石蜡密封时使用。
单击“确定”将温度和热罩控制设置应用于程序,或单击“取消”关闭此窗口,而不更改程序使用的设置。
该设置将出现在程序列表和图形显示上方的控制和盖子设置区域。
设计和输入程序本节将给出一个程序的例子,并介绍如何输入程序步骤,以及程序选项。
例子如下:
1,94度30秒;
2,复性温度是一个温度梯度,在12个柱中范围从55度到65度;3.读取空白、定量标准和样品孔的荧光强度;4、72度保温1分钟;
5,重复步骤1-4,添加24次,然后进入步骤6;
6,通过熔融曲线检测反应产物的纯度,具体步骤如下:
温度从55度升至90度,每升1度测量荧光强度10秒;
7,程序结束输入新程序:
当您在程序中输入一个步骤时,该步骤的描述将出现在程序的上部显示窗口中,同时在下部会出现一个图表来解释该步骤的温度和时间。
使用水平缩放滑块和滚动条可以更清楚地查看程序图在进入一个新程序之前,你可以在显示窗口上方看到一个加深的结束步骤。
在Opticon2监控软件中,增加的步骤先于深化的步骤温度步骤温度步骤决定温度和保温时间。
如果程序中没有设置温度上升和下降速度,DNA引擎Opticon2系统将尽快达到该温度(参见本节末尾的“手动斜坡率”)单击温度按钮进入保温步骤(例如示例中的步骤1和4)
在“将温度设置为”列中输入0到105度之间的温度,或者使用滚动条进行选择,例如,示例中的第一步是94度在“保持时间”栏中输入保持时间,最长为18小时当单击:
分钟:
秒并输入时间时,您也可以使用滚动条来选择,例如,示例中第一步的00:
00:
30您还可以选择“永久”将样品保存在特定温度下一段定制的时间。
它通常用于在程序完成后将样品储存在较低的温度下,建议温度为10度。
永久保存表示为∣形如果没有进一步修改,请单击“插入”将温度步长添加到程序中。
该步骤立即出现在上部程序显示窗口和下部图表中。
请注意,变暗步骤再次结束,这表示下一个插入步骤是在结束之前和第一个步骤之后。
在将步长插入程序之前,您还可以通过选项修改温度步长,这些选项包括
1和手动斜坡率:
设置低于最高速率的斜坡率。
可以设置在每秒0.1到2.5度之间。
保温步骤之间的快速升温和降温可节省总反应时间10%-30%,有利于减少非特异性扩增产物
2,增加温度:
修改温度步长,使每个循环增加或降低一定的温度(0.1-10度/循环)这种方法通常用于复性在
的复性过程中,复性温度从高于计算温度开始,然后在每个循环中逐渐降低,达到甚至低于计算温度这种复性温度由高到低的策略有利于在早期循环中获得理想的扩增产物。
3.延长时间:
修改温度步骤,使每个周期延长或缩短保持时间(1-60秒/周期)
该方法通常用于在延长步骤中缓慢增加延长时间(通常为2-5秒/周期)。
在反应的最后几个循环中,由于酶活性的降低和模板分子数量的增加,每个酶分子所处的合成碱基的数量在延伸过程中大大增加,因此延伸时间的延长随着利用的延长而更加完全。
4,完成时发出蜂鸣声:
当达到目标温度时,机器发出蜂鸣声梯度步骤温度梯度功能允许您同时优化几种不同的变性或复性温度从左到右,96孔样品模块
的温度可以相差1度到24度。
最高温度为105度,最低温度可达30度。
单击渐变按钮在程序中插入渐变步骤
最左边的一列(第1列)是温度梯度的最低温度,其设定值应在30-104度之间在我们的示例中,在“将温度设置为”列中,L=55最右边的一列(第12列)是温度梯度的高温,其设定值应在31-105度之间在我们的例子中,R=65最左列和最右列之间的最小温差为1度,最大温差为24度。
输入温度梯度范围后,在“保持”栏中输入保持时间您可以单击小时:
分钟:
秒并输入时间,也可以使用滚动条在示例的第二步中选择例如00:
00:
30度您还可以选择“永久”将样品保存在特定温度下一段定制的时间。
如果不再修改
,请单击“插入”将该步骤添加到程序中。
梯度步长将在程序显示窗口中显示为步长2请注意,变暗步骤再次结束,这表示下一个插入步骤在结束之前和步骤2之后。
您也可以在将梯度步长插入程序之间选择延长时间选项(请参见“温度”部分中对这些选项的解释)梯度计算器要知道梯度绝缘过程中每一列的准确温度,请单击工具菜单并选择梯度计算器。
请注意,温度梯度不是线性的,中间孔的温度区间很大。
这是由模块下加热器的结构造成的。
每个洞的温度都非常准确。
通过温度梯度获得的结果在下面的非梯度程序中可以非常好。
板读取步骤插入板读取步骤可以指示Opticon2检测器对样品、定量标准和空白孔进行荧光测量完成前一个绝缘步骤后,立即读取电路板,如示例中的步骤2。
在开始下一步之前,如示例中的步骤4,在当前保持温度下完成读取板。
要插入板读取步骤,单击板读取按钮,板读取步骤将被插入程序。
在我们的示例中,阅读板步骤显示为步骤3。
在图中,阅读板由一个眼睛形状的图标表示。
添加多个温度步骤、梯度步骤和板读取步骤要添加多个温度步骤、梯度步骤和板读取步骤,请按相应的按钮并遵循以下步骤的说明在我们的示例中,第四步是72度绝缘00:
01:
00,没有其他选项循环步进循环步骤的目的是使许多重复的步骤不必一步一步地输入和显示。
当程序运行到循环步骤时,程序返回到指定的步骤,并运行从该步骤到循环步骤的所有步骤。
循环执行了指定次数后,程序继续循环步骤的下一步在我们的示例中,步骤5是返回到步骤1的循环。
重复步骤1-424次,总共25次,然后继续步骤6这些都包含在循环步骤中
单击“转到”按钮输入程序返回的步骤号在我们的示例中,Goto列中的输入是1,还有多少次?
该列中的输入是24该步骤5将指示程序在进入步骤6之前重复步骤1-424次。
单击插入按钮将循环步骤添加到程序中。
熔化曲线步骤:
熔化曲线可用于确定特定碎片和分析产品的同质性解链曲线受许多因素影响,包括产物的数量和浓度、片段长度和G+C含量,以及影响核酸变性温度的其他因素,如缓冲液等。
要执行熔化曲线步骤,请单击熔化曲线按钮。
输入起始温度(0.0-99.0度)和结束温度(1.0-100.0度)在我们的示例中,开始和结束温度分别为55度和90度。
此外,在熔化曲线步骤中,Opticon2还用于检测和测量荧光强度。
在“读数之间的温度增量”一栏中输入温度(0.1-10.0度),以确定温度增加多少度。
在“读取之间的保持时间”一栏中输入一个时间(1秒-1小时),以确定温度应保持恒定的读取周期。
通常,建议每次温度上升0.2度时读取电路板,读取周期为1秒。
单击“插入”按钮,将熔化曲线步骤添加到程序中每个程序中只能有一个熔化曲线步骤
编辑一个步骤要编辑程序的一个步骤,首先在程序显示窗口中单击该步骤将其加深,然后单击编辑步骤按钮将显示该步骤的各种参数。
将它修改为所需内容后,单击“替换”按钮将已编辑的步骤添加到程序中,或者单击“取消”按钮取消编辑。
删除步骤要删除程序的某个步骤,首先在程序显示窗口中单击该步骤将其深化,然后单击删除按钮从程序中删除该步骤。
剩余的程序步骤将自动重新编号。
要在现有步骤中插入一个步骤,首先在程序显示窗口的
端口中单击下一个步骤将其深化。
所有添加的步骤都在此步骤之前然后单击相应的按钮插入要插入的步骤。
输入所有程序文件参数后,单击程序文件窗口左上角的确定按钮保存程序文件并返回主文件窗口。
主文件的程序设计部分将显示程序图、板读取总数、熔化曲线和近似运行时间。
单击取消按钮返回主文件窗口,不保存程序文件。
熔化曲线分析熔化曲线可用于识别特定碎片或评估样品的均匀性解链曲线受超过
个因素的影响,如片段的浓度和数量、每个片段的长度和G+C含量,以及缓冲条件等其他因素。
所有这些都会影响核酸的解链温度。
Opticon2可以自动完成熔化曲线这种分析可用于多种目的,包括恒温试验、片段大小鉴别和使用96个Opticon2样品的高通量终点分析。
要完成独立于周期的熔化曲线分析,请单击熔化曲线按钮。
输入起始温度(0.0-99.0度)和结束温度(1.0-100.0度)此外,在熔化曲线步骤中,Opticon2还用于检测和测量荧光强度。
在“读数之间的温度增量”一栏中输入温度(0.1-10.0度),以确定温度增加多少度。
在“读取之间的保持时间”一栏中输入一个时间(1秒-1小时),以确定温度应保持恒定的读取周期。
一般建议
的温度每上升0.2度,读取时间为1秒。
单击插入按钮向程序中添加熔化曲线步骤每个程序只能有一个熔化曲线分析步骤
保存程序文件要保存新生成的程序文件,请从主文件窗口的编程部分选择保存按钮在保存窗口的文件名字段中输入合适的名称单击保存按钮以保存为.prot文件。
当然,光是这些还远远不够,还有许多事情要做...以上总结仅适用于我们的试剂和仪器。
关于仪器的使用说明,见附件
温度上升0.2度,板读数周期为1秒。
单击插入按钮向程序中添加熔化曲线步骤每个程序只能有一个熔化曲线分析步骤
保存程序文件要保存新生成的程序文件,请从主文件窗口的编程部分选择保存按钮在保存窗口的文件名字段中输入合适的名称单击保存按钮以保存为.prot文件。
当然,光是这些还远远不够,还有许多事情要做...以上总结仅适用于我们的试剂和仪器。
有关使用仪器的说明,请参见附件
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