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DNA光复活过程电子转移机理的脉冲辐解研究cropped
DNA光复活过程电子转移机理的脉冲辐解研究_cropped
DNA光复活过程电子转移机理的脉冲辐解研究
晏利琴,高华英,王梅
()安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽省功能性分子固体重点实验室,安徽芜湖241000
摘要:
采用脉冲辐解瞬态吸收光谱法研究了水溶液中水合电子引发cis2syn型1,32二甲基尿嘧啶
()环丁烷型二聚体DMUD裂解,生成嘧啶单体和嘧啶阴离子自由基,以及在维生素K存在下,嘧啶3
阴离子自由基和VK之间的电子转移反应过程,测定了电子转移反应的速率常数.当没有VK作33
为电子受体时,嘧啶阴离子自由基能继续和DMUD进行链反应.
关键词:
环丁烷型嘧啶二聚体;脉冲辐解;电子转移;维生素K;DNA光复活作用3
中图分类号:
O644.1文献标识码:
A()文章编号:
1001-2443200603-0245-04
()近年来,随着大气臭氧层的消耗,生物圈受到紫外线UV线伤害日益严重.DNA是UV作用于生物体的
1主要靶分子,UV导致的DNA损伤的主要光化学产物是环丁烷型嘧啶二聚体CPD,这些二聚体阻碍了DNA
2的复制和转录.在光复活过程中,DNA光解酶特异性地结合到含CPD的DNA上,在近UV2Vis光下,DNA光-()()解酶中“天线”辅酶UQ吸收光子并将能量传递给催化辅酶FADH,活性形式为FADH-,被激发的FADH22,3,4()向CPD转移一个电子,使其裂解,恢复DNA双螺旋结构图1.
DNA光复活作用机理研究引起了生物学家和
4210化学家的关注,取得了许多研究成果.光解酶
在自然界广泛存在,但人类自身不含有这种
4,11.为了弄清光复活的详细过程及多种因素的酶
影响规律,模型研究从分子水平上解释了诸多的生
7()物学现象.维生素KVK是一类萘醌衍生物,其
主要生理作用是促进血浆凝血因子的合成,在凝血酶原的合成过程中VK经历了酶促醌氢醌式氧化12()DNA中同一链上相邻的胸腺嘧啶核苷酸在紫外光2002300nm作图1(还原过程.VK类化合物中VK化学名:
12甲基23(用下生成胸腺嘧啶二聚体;逆反应,光解酶利用近紫外2可见光3002)1,42萘醌磺酸钠是一种人工合成的化合物,它也)500nm进行光复活作用
是生物活性最强的VK类药物.VK在PH>6的水3Fig.1Thyminedimerformationbystackedthyminenucleotidesinthesame13()strandofdouble2strandDNAinducedbyUVlight2002300nm;Thereverse溶液中会解离生成22甲基21,42萘醌,VK与UQ3
()reactioniscatalysedbyDNAphotolyase,whichusesUVlight3002500nm.一样,在生物膜的电子传递系统内都是氧化还原的
主要成分,是一种很好的电子受体.
本文以纳秒级的脉冲辐解瞬态吸收光谱为手段,研究嘧啶二聚体接收一个电子裂解成单体和单体自由
基及其后与VK之间的电子转移反应,以及相关的动力学行为.3
1实验部分
1.1实验方法-?
?
水辐解产生的水合电子与基质作用可产生短寿命的阴离子自由基R,而水辐解产生的OH自由基可
14?
():
OH被加入的t2BuOH清除转变为不活泼的CHCH232
?
?
-()HO?
H,OH,e,HO,H,12aq222
收稿日期:
2006-01-19
()基金项目:
安徽师范大学青年基金2004XQN13.
()作者简介:
晏利琴1974-,女,安徽含山人,副教授,博士.
?
?
()()()2OH+CHCOH?
CHCHOH+HO.332322
-?
-?
适当选择R与VK的浓度比,可观察到R与VK间的电子转移反应,并从VK在340nm处的生成曲333线求得该电子转移反应的速率常数.
-?
-?
()R3+VK?
VK+R.33
()对一定浓度范围的VK而言,其阴离子自由基的形成速率均可视为准一级反应.据此可导出反应式33
-?
的表观衰减速率常数K=kVK+kR.改变VK的浓度,测得一系列R的K,以VK的浓度对Kobs+3-3obs3obs
-?
作图为一条直线,从而得到R与VK的反应速率常数.3
1.2实验试剂和装置
()()cis2syn型1.32二甲基尿嘧啶二聚体DMUD由本实验室用1.32二甲基尿嘧啶DMU为原料合成;
()()VitaminKVK为生化试剂,用三次蒸馏水重结晶;叔丁醇t2BuOH经蒸馏纯化.磷酸盐未经纯化直接使用.33
N纯度为99.99%.样品辐照前用N除去氧气,鼓泡时间不少于20min.样品均用三次蒸馏水配制,用22
NaHPO和KHPO缓冲液调节pH值为7,0.5M的t2BuOH消除羟基自由基.试验在室温下进行.242415,16本实验在纳秒级脉冲辐解瞬态吸收光谱装置上进行.所用加速器的能量为8MeV、电子脉冲宽度为
228ns、脉冲电流2-3A,分析光垂直通过2cm的石英池.以空气饱和的1×10MKSCN溶液进行单脉冲剂量的-?
-1-1()标定,辐照产生的KSCN的产额G=2.9,它在480nm处的摩尔消光系数为7600Lm?
olc?
m.详细()2KSCN22
16的设备及实验条件参见有关文献.
2结果与讨论
2.1水合电子与DMUD的反应
24图2为经N脱氧的2×10molΠLDMU,t2BuOH及2
pH=7的磷酸缓冲溶液经脉冲辐解后观察到的瞬态吸
μ收光谱,辐解0.7s后,在最大值约710nm处有一强吸17收峰,此为水合电子的特征吸收.随着水合电子峰-?
μ的衰减,DMU在电子脉冲结束后1.5s达到最大吸
收值,且最大吸收峰在290nm附近.在此实验条件下溶
液中,水辐解产生的活性粒子基本只剩下水合电子
--e,DMU与e反应过程可表示为:
aqaq--?
()e4+DMU?
DMU.aq24)()(图2N饱和的含有2×10molΠLDMU空心,DMUD实心,5×242从图2可以看出经N脱氧的2×10molΠL222μ(10molΠLt2BuOH的中性稀溶液的脉冲辐解瞬态吸收谱图0.7s圆DMUD,t2BuOH及pH=7的磷酸缓冲溶液经脉冲辐解)μ)(形,1.5s三角形.内插图:
含DMUD的溶液脉冲辐解后在290和后观察到的瞬态吸收光谱,与DMU溶液的瞬态吸收光710nm处吸收值随时间变化的曲线
Fig.2TransientabsorptionspectrainthepulseradiolysisofN2staturedμ2谱相比较几乎完全相同,1.5s后在290nm处的生成24-?
)((aqueoussolutioncontaining2×10molΠLDMU?
and?
andDMUD?
轨迹也几乎一致.表明该溶液中有DMU生成,且由22)()()μ(and?
and5×10molΠLt2BuOHPH=7at?
and?
0.7s,?
实验数据可以看出此处峰生成的时间也与含DMU的)μand?
1.5s.Insert:
thetimedependenceontheabsorbancesat290and-?
溶液中DMU生成的时间大致相同.嘧啶二聚体和水710nm.合电子反应导致二聚体裂解为一个单体和一个单体阴9-?
离子自由基的过程已经被普遍接受.因为DMUD与水合电子反应生成的DMUD裂解过程非常快,在本仪-?
-?
器上无法观察到,谱图中290nm处的吸收峰为DMUD裂解生成的DMU的吸收.推测其机理为:
--?
-?
()+DMUD?
DMUD?
DMU+DMU.e5aq-改变DMUD的浓度,可观测710nm处e的衰变,并求出DMUD与水合电子的反应速率常数为7.9×aq9-1-110Ms.?
-2.2DMUD与VK之间的电子转移反应3
-3-5图3为含4×10molΠLDMU,5×10molΠLVK,t2BuOH及pH=7的磷酸缓冲溶液经N脱氧脉冲辐解32-?
?
?
14后观察到的DMU瞬态吸收谱图.水辐解产生的H很少,因此H与底物反应可以忽略.此时的吸收主要
-9-1-1-10-1)((来源于e与DMUD反应速率常数为7.9×10Ms或e与VK反应反应速率常数为3.1×10Maqaq3
-118-?
-)μs生成的阴离子自由基.可以看出,电子脉冲结束0.5s后的瞬态吸收与DMU的吸收谱相似,表明eaq
-?
-?
--?
(首先与DMUD反应生成DMUD进而裂解成DMU和DMU.体系中的VK也可能与e反应生成VK,但3aq3
--根据两者各自与e反应速率常数及其浓度的大小,可算出有96%以上的e首先被DMUD捕获生成aqaq
-?
-?
-?
μDMUD进而裂解成DMU和DMU.而图3中20s的瞬态吸收谱中350nm附近的强吸收峰归属于DMU向
-?
VK转移一个电子所生成的VK的特征吸收,其电子转移反应为:
33
-?
-?
()6DMU+VK?
DMU+VK.33
+-?
当溶液中H浓度达一定值时,VK会发生质子化转变为中性自由基:
3
+-?
?
()H+VK?
VKH.733
-3-2-5图3N饱和的含4×10molΠLDMUD,5×10molΠLt2BuOH和5×102μ)μ)((molΠLVK的中性水溶液的脉冲辐解瞬态吸收谱:
1.5s?
5s?
3
μ)(20s?
.内插图:
350nm处吸收值随时间的变化曲线
Fig.3TransientabsorptionspectrainthepulseradiolysisofN2staturedaqueous2-3-2-5solutioncontaining4×10molΠLDMUD,5×10molΠLt2BuOHand5×10molΠLVK3
()()μ)μ)μ((PH=7at?
1.5s,?
5s,?
20s.Insert:
thetimedependenceon
theabsorbancesat350nm
9-1-1()以VK的浓度对上式的K作图,可求出式6的电子转移速率常数为5.8×10Ms.3obs
3结论
嘧啶二聚体与水合电子反应,形成嘧啶二聚体阴离子自由基,接着裂解成一个单体和一个单体阴离子自
19由基.Heelis等提出单体阴离子自由基和二聚体之间发生了一个链反应:
-?
-?
()7DMU+DMUD?
DMU+DMUD,
-?
-?
()DMU+DMUD?
2DMU+DMU.8
在没有VK作为电子受体时,DMUD发生了链反应.而在有VK作为电子受体的情况下,链反应根本不334发生.这一过程类似于生物体在DNA光解酶催化下进行的DNA复活作用,只是速度要慢很多.
致谢:
感谢中国科学院上海原子核研究所辐射化学实验室对本项工作的支持.
参考文献:
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PulseRadiolysisStudiesoftheElectronTransferMechanism
intheDNAPhotoreactivationProcess
YANLi2qin,GAOHua2ying,WANGMei
()CollegeofChemistryandMaterialsScience,AnhuiKeyLaboratryofFunctionalMolecularSolids,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,ChinaAbstract:
Utilizingapulseradiolysisequipmentwithtime2resolvedopticaldetector,kineticprocessesofelectron2induced
()splittingofcis2syn1,32dimethyluracilcyclobutanedimerDMUDinaqueoussolutionareinvestigatedinthepresenceor
()absenceofVitaminKVK.Ithasbeenobservedthatcyclobutanepyrimidinedimerreactingwithhydratedelectron33
splitsspontaneouslytogiveamonomerandamonomerradicalspeciesandtherateconstantsofelectrontransferfromthemonomerradicalaniontoVKhavebeendetermined.OnthebasisofcomparisonoftheinteractionsbetweenDMUDand3
hydratedelectroninthepresenceandabsenceofVK,achainreactionprocessintheabsenceofVKhasbeen33demonstrated.
Keywords:
cyclobutanepyrimidinedimer;pulseradiolysis;electrontransfer;vitaminK;DNAphotoreactivation3
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