ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitK说明书第一链cDNA合成试剂盒.docx

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ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitK说明书第一链cDNA合成试剂盒

RevertAid第一链cDNASynthesis试剂盒

#K1621,#K1622

分析证明书

#K1621

Lot

质量控制

采用100fg对照GAPDHRNA和对照引物进行RT-PCR反应，通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴

化乙锭染色显示得到足够量的496bp的产物

质量认证人：

JurgitaZilinskiene

页码

试剂盒组成…………………………………………………………….2存储条件……………………………………………………………….2产品说明……………………………………………………………….2注意事项…………………………………………………………….....3操作步骤…………………………………………………………….....6

RT-PCR…………………………………………………………….6合成cDNA用于克隆………..………………………………………7实验对照……………………………………………………………….8问题分析与解决……………………………………………………...10

试剂盒成分

RevertAid第一链cDNA合成试剂盒

20次

#K1621

100次

#K1622

RevertAidM-MuLV反转录酶（200u*/μl）

25μl

120μl

RiboLockRNA酶抑制剂（20u**/μl）

25μl

120μl

5×反应缓冲液

（250mMTris-HCl（pH,250mMKCl,20mMMgCl2,50mMDTT）

150μl

500μl

10mMdNTP混合物

50μl

250μl

Oligo（dT）18引物100μM,μg/μl（15A260u/ml）

25μl

120μl

随机六聚体引物100μM,μg/μl（6A260u/ml）

25μl

120μl

GAPDH正向引物,10μM

5’–CAAGGTCATCCATGACAACTTTG–3’

20μl

20μl

GAPDH反向引物,10μM

5’–GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’

20μl

20μl

对照GAPDHRNA

kb3’-poly（A）tailedRNAtranscript,μg/μl

20μl

20μl

无核酸酶高纯度水

ml

ml

*一个单位的RevertAidM-MLV逆转录酶在37℃10分钟将1nmol的dTMP转化为多核苷酸组分（吸附在DE81上）。

**一个单位的RiboLockRNase酶抑制剂抑制5ngRNA酶A50%的活性。

存储条件

试剂盒中所有组分应存储在-20°C。

对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。

产品说明

RevertAid第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。

本试剂盒使用RevertAidM-MuLV反转录酶，它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。

该反转录酶可耐受42-50°C温度，合成的cDNA片段长度达13kb。

试剂盒中含有RiboLock重组RNA酶抑制剂，防止RNA降解，可耐受55°C高温。

试剂盒同时含有oligo（dT）18和随机六聚体引物。

随机六聚体引物与模板非特异性地结合，以总RNA

中任何RNA为模板合成cDNA。

oligo（dT）18选择性和RNA3’poly（A）配对结合，只以有poly（A）尾巴的

mRNA为模板合成cDNA。

使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。

合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，

也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验，比如将标记好的第一链cDNA

作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。

注意事项

避免核酸酶污染

RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。

RNA很容易被RNA酶A降解，而RNA酶A广泛稳定地存在于实验室中。

试剂盒中的所有成分都经过了无RNA酶的严格验证并保证不含有RNA酶。

为防止污染，实验室和所有实验准备工作都必须保证没有RNA酶污染。

避免RNA酶污染的常规建议：

●用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具。

●整个实验过程戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。

并经常更换手套。

●使用无RNA酶的试剂，即使是超纯水也要确保无RNA酶（比如#R0581，无RNA酶的高纯度水）

●使用RNA酶抑制剂，比如试剂盒中提供的FermentasRiboLockRNA酶抑制剂来保护RNA。

●试剂盒如不使用，要严格密封保存。

在反转录过程中，所有管子要确保扣严。

模板RNA

通过标准方法得到的细胞总RNA可用本试剂盒获得第一链cDNA。

纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。

可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物（然后再用75%冷乙醇冲洗沉淀两次）。

如果要进行RT-PCR，模板RNA要确保没有DNA污染。

在进行cDNA合成前，模板RNA必须用无RNA酶的DNA酶I（#EN0521）处理去除掉痕量DNA。

实验过程要设置无RT对照反应，即此对照反应中含有除逆转录酶以外的其他所有RT-PCR成分（RT-对照）。

去除RNA中基因组DNA的实验步骤:

1.将以下成分加入到一个无RNA酶的管子中：

RNA

1μg

10×反应缓冲液（含有MgCl2）

1μl

DNA酶I，无RNA酶（#EN0521）*

1μl（1u）

无核酸酶的高纯度水

加到10μl

*对于每1μgRNA，不要使用超过1u的DNA酶I（不含RNA酶的）。

2.37°C孵育30分钟。

3.加入1μl50mMEDTA，65°C孵育10分钟。

在含有二价阳离子

（1）而缺乏螯合剂的环境中，RNA

会水解。

或者可采用酚/氯仿试剂抽提的方法来替代加EDTA孵育这一步骤。

4.使用制备好的RNA为模板进行逆转录反应。

RNA样品品质在进行cDNA合成前，要先评估RNA的完整性。

最经常使用的方法是跑变性的琼脂糖凝胶，然后用

溴化乙锭（简称EB，以下同）染色。

如果来源于真核细胞的总RNA在跑完胶后可清晰看到18s和28srRNA

的条带，可认为RNA是完整的。

28srRNA的条带亮度约为18srRNA的两倍。

任何拖尾条带都是mRNA

降解的信号。

如果这种拖尾条带出现，需要重新提取总RNA样品。

为了进行RT-PCR，需要评价纯化的RNA（人类，小鼠或大鼠）的适用性。

常用方法是在RT-PCR中设置对照，此对照含有试剂盒中提供的模板RNA和对照用GAPDH引物。

GAPDH特异性引物与人，小鼠，大鼠的GAPDH基因完全互补，RT-PCR扩增后得到496bp的产物。

RNA样品用量

●ng-5μg的总RNA或者1ng-500ng的poly（A）mRNA作为模板合成第一链cDNA，此反应可作为两步法RT-PCR中的起始步骤。

●使用1μg分离纯化的mRNA作为模板合成的第一链cDNA，可用于第二链合成或者后续克隆反应。

引物合成第一链cDNA使用的引物可为oligo（dT）18引物，随机六聚体引物或者基因特异性引物中的任意

一种。

Oligo（dT）18引物针对具有3’poly（A）尾巴的真核mRNA。

随机六聚体引物适用于总RNA（rRNA或

者mRNA）。

因此，相对Oligo（dT）18，使用随机六聚体引物会得到更复杂的第一链cDNA混合物，这样会降低后续PCR实验的特异性和精确性。

但是随机引物在以下几种情况中是有优势的：

比如没有poly（A）尾巴的mRNA或者使用富含poly（A）结构的RNA为模板。

基因特异性引物用于从总RNA或者mRNA混合物中合成特异性的某条或者几条cDNA，这种特异引物需要使用者自己提供。

第一链cDNA合成过程第一链cDNA合成可进行单样本反应，可以使用不同的模板平行进行多样本反应。

因此，准备反应

混合物可每种反应组分单独加入，也可使用mastermix（mastermix含有除去模板RNA的以外的其他反应组分）。

取决于RNA模板结构的情况，将变性和退火分开操作可能会提高RT-PCR的特异性和精确度。

下面图表描述的是第一链cDNA合成的主要步骤。

详细步骤请见第六页。

图表中描述了包括RNA变性步骤的单样本反应和使用不同模板的多样本反应流程。

与单样本反应相比，多样本反应采用相同的反应体系（20ul）和相同的试剂用量，但试剂的加入顺序有所不同（见下图）。

图表1.合成cDNA的单样本反应和多样本反应的实验过程概述

有RNA变性

单样本反应多样本反应

无RNA变性

有RNA变性

无RNA变性

（简化的操作步骤）

（简化的操作步骤）

混合RNA和引物，

至12μl

混合RNA和引物，

至5μl

65℃变性处理5分钟，置于冰上

65℃变性处理5分钟，置于冰上

准备无RNA和引物的反应混合液

准备无RNA的反

应混合液

将上述反应液加到管子中

加入缓冲液，

RNA酶抑制剂，dNTP，RevertAidTM酶

（共20μl）

加入RNA，引物，

buffer，RNA酶抑制剂，dNTP，RevertAidTM酶

（共20μl）

将上述反应液、RNA和引物加到管子中（共20μl）

加入模板RNA

（共20μl）

在42℃下孵育60分钟

（对于oligo（dT）18引物或基因特异性引物）

或在25℃下孵育5分钟

在42℃下孵育60分钟

（对于随机引物）

在70℃下孵育5分钟终止反应

操作步骤

开始前请先阅读第3-5页的注意事项。

RT-PCR

I.第一链cDNA合成融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心，离心后置于冰上。

1.在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物。

模板RNA

总RNA

或者poly（A）mRNA

或者特异性RNA

ng-5μg

10pg-μg

pg-μg

引物

oligo（dT）18引物

随机六聚体引物基因特异性引物

1μl

1μl

15-20pmol

无核酸酶的高纯水

到12μl

总体积

12μl

2.可选优化步骤。

如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，将模板和引物的混合液轻轻混匀，

短暂离心，65°C孵育5分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。

3.将下列组分按照顺序加入

5XReactionBuffer

RiboLockRNA酶抑制剂（20u/μl）

10mMdNTPMix

4μl

1μl

2μl

RevertAidM-MuLV逆转录酶（200u/μl）

1μl

总体积

20μl

4.轻轻混匀，离心。

5.如果使用oligo（dT）18或者基因特异型引物，42°C孵育60分钟。

如果使用随机六聚体引物，25°C.先孵育5分钟，随后42°C孵育60分钟。

注意：

高GC含量的模板反应温度可升高至45°C。

6.70°C加热5min终止反应。

反应产物可直接用于PCR反应或者在-20°C保存少于一周的时间。

如想延长保存时间，建议使用

-70°C保存。

II.第一链cDNA的PCR扩增合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。

第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的

1/10。

通常50μl的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2μl。

TaqDNA聚合酶，PCRMasterMix

（2X）或者PyroStartFastPCRMasterMix（2X）可用于扩增小于3kb的片段。

DreamTaqDNA聚合

酶扩增至6kb长的片段。

对于20kb的长片段，建议使用LongPCREnzymeMix和HighFidelityPCREnzymeMix。

合成cDNA用于克隆

I.第一链cDNA合成融化后，将试剂盒中各组分混匀并短暂离心，离心后置于冰上。

1.在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物。

模板RNA

poly（A）mRNA

或特异性RNA

1μg

μg

引物

oligo（dT）18引物

或随机六聚体引物

或基因特异性引物

1μl

1μl

100pmol

无核酸酶的高纯水

至12μl

总体积

12μl

2.可选优化步骤。

如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，轻轻混匀，短暂离心，65°C孵育5

分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。

3.将下列成分按照顺序加入

5XReactionBuffer

4μl

RiboLockRNA酶抑制剂（20u/μl）

1μl

10mMdNTPMix

2μl

RevertAidM-MuLV逆转录酶（200u/μl）

1μl

总体积

20μl

4.轻轻混合，离心。

5.如果使用oligo（dT）18或者基因特异型引物，42°C孵育60分钟。

如果使用随机六聚体引物，25°C.先孵育5分钟，随后42°C孵育60分钟。

注意：

高GC含量的模板反应温度可升高至45°C。

6.70°C加热5min终止反应。

反应产物可直接用于PCR反应或者在-20°C保存少于一周。

如想延长保存时间，建议使用-70°C保存。

II.第二链cDNA合成

1.在冰上将下表的组分加入到20μl第一链cDNA反应混合液中：

10XReactionBuffer（适用于DNA聚合酶I）

8μl

RNA酶H,（#EN0201）

1u

DNA聚合酶I,（#EP0041）

30u

无核酸酶的高纯水

至100μl

总体积

100μl

2.轻轻混匀，短暂离心。

3.15°C孵育2小时。

温度不要高于15°C。

4.加入uT4DNA聚合酶（#EP0061），15°C孵育5min。

5.加入5μlofMEDTA,pH（#R1021）终止反应。

6.通过酚/氯仿抽提纯化平端的cDNA，以用于的克隆相关实验，比如：

接头连接，磷酸化，片段大小分离，连接和转化。

实验对照

应该采用阴性和阳性对照来验证第一链cDNA合成的结果。

●无逆转录酶的阴性对照（RT-）在PCR或者qPCR反应中很重要，它可用于评估基因组DNA对RNA

样品的污染状况。

RT-对照组不含有逆转录酶，但含有实验所需的其他组分。

●无模板的阴性对照（NTC）对于检测反应试剂的污染情况很重要。

NTC对照组不含有RNA模板，但含有实验所需的其他组分。

●阳性对照试剂盒中已经提供阳性对照所需的RNA模板和基因特异性引物。

人GAPDH对照RNA是通过体外转录方式得到的。

GAPDH特异性引物与人，小鼠，大鼠的GAPDH基因完全互补，RT-PCR后的产物长度大约496bp。

下面是阳性对照的操作步骤。

I.阳性对照第一链cDNA的合成反应融化后，将试剂盒中各组分混匀并短暂离心，离心后置于冰上。

1.在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按照顺序加入下面的反应物。

对照GAPDHRNA（50ng/μl）

2μl

Oligo（dT）18引物

或随机六聚体引物

或基因特异性引物

1μl

5XReactionBuffer

4μl

RiboLockRNA酶抑制剂（20u/μl）

1μl

10mMdNTPMix

2μl

RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase（200u/μl）

1μl

无核酸酶的高纯水

9μl

总体积

20μl

2.轻轻混匀离心。

3.如果使用oligo（dT）18或者基因特异型引物，42°C孵育60分钟。

如果使用随机六聚体引物，25°C.先孵育5分钟，随后42°C孵育60分钟。

4.70°C加热5min终止反应。

5.短暂离心，按照第九页的操作步骤进行对照PCR扩增。

II.对照PCR扩增

1.将第一链cDNA合成反应液（第8页）按照1:

1000的比例用无核酸酶的水高纯水稀释。

2.其他组分融化后，轻微震荡混匀并离心。

3.薄壁PCR管置于冰上，加入下列试剂：

从对照RT反应得到的cDNA（1:

1000dilution）

2μl

10XPCRbuffer

5μl

10mMdNTPMix

1μlmMeach）

25mMMgCl2

3μl

正向GAPDHPrimer

μl

反向GAPDHPrimer

μl

TaqDNApolymerase（5u/μl）

μl

无核酸酶的高纯水

μl

总体积

50μl

4.进行PCR反应，PCR仪要有加热的盖子，或者在PCR管中加入25μl的矿物油。

步骤

温度,°C

时间

循环数

初始变性

94

3分钟

1

变性

94

30秒

35

退火

58

30秒

延伸

72

45秒

5.将5-10μlRT-PCR产物上1%琼脂糖电泳。

EB染色后应该清晰可见496bpPCR产物。

问题分析与解决

存在问题

原因和解决办法

产物产量低或者

没有RT-PCR产物

RNA模板降解

RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA非常重要。

不要忘记在进行cDNA合成实验前检测RNA的完整性，真核细胞的RNA在跑完变性胶后可看到18s和28srRNA的锐利条带。

参考第3页的建议避免RNA酶的污染。

模板纯度低RNA纯化过程中使用的一些痕量成分可能会残存在溶液中并抑制第一链合成，比如SDS，EDTA，胍盐，磷酸盐，焦磷酸盐，聚胺，亚精胺。

可采用乙醇沉淀方法去除掉痕量污染物（乙醇重新沉淀RNA，再用75%冷乙醇冲洗沉淀）。

RNA模板量不够模板增加到建议使用量。

随后才用DNA酶I处理，在EDTA存在下（螯合镁离子），加热失活终止反应，具体操作见第3页。

在缺乏螯合剂的加热的环境中，RNA会水解

（1）。

引物选择不正确使用针对RNA模板的正确引物。

细菌RNA或者不含有poly（A）尾巴的RNA，使用随机六聚体引物替代oligo（dT）18。

确保序列特异性引物与模板的3’端互补。

模板GC含量高如果模板GC含量高或者富含二级结构，将反转录温度提高到45°C.

RT-PCR产物比

预计的长

RNA模板被基因组DNA污染

基因组DNA中的内含子被扩增。

在进行反转录之前用DNA酶I进行消化（详见第

3页操作步骤）。

为避免基因组DNA的扩增，引物设计在外显子和内含子连接区。

阴性对照中含有

RT-PCR产物

RNA模板被基因组DNA污染

PCR产物在RT-阴性对照中表明反应中有基因组DNA污染。

在进行反转录之前用

DNA酶I进行消化（具体详见第三页操作步骤）。

参考文献

1.Wiame,I.,etal.,IrreversibleheatinactivationofDNaseIwithoutRNAdegradation,BioTechniques,

29,252-256,2000.

RevertAid,RiboLock,PyroStartandDreamTaq均为Fermentas持有的商标。

产品使用限制说明

本产品用于体外科学研究之用，不可用于诊断或者药物研发，也不可用于人类或者动物体。

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