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化学发光原理和应用
化学发光及生物发光的原理及其应用
第一部份 概述
化学发光(ChemiLuminescence,简称为CL)分析法是分子发光光谱分析法中的一类,它主若是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在必然条件下呈线性定量关系的原理,利用仪器对体系化学发光强度的检测,而确信待测物含量的一种痕量分析方式。
化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光(光辐射)所吸收的能量来源不同。
体系产生化学发光,必需具有一个产生可检信号的光辐射反映和一个可一次提供致使发光现象足够能量的单独反映步骤的化学反映。
化学发光体系用化学式表示为:
依据供能反映的特点,可将化学发光分析法分为:
1)一般化学发光分析法(供能反映为一样化学反映);2)生物化学发光分析法(供能反映为生物化学反映;简称BCL);3)电致化学发光分析法(供能反映为电化学反映,简称ECL)等。
依照测定方式该法又可分为:
1)直接测定CL分析法;
2)偶合反映CL分析法(通过反映的偶合,测定体系中某一组份;
3)时刻分辨CL分析法(即利用多组份对同一化学发光反映阻碍的时刻差实现多组份测定);
4)固相、气相、掖相CL。
分析法;
5)酵联免疫CL分析法等。
化学发光的系统一样能够表示为:
在整个的检测系统中其关键的部份为PMT,其直接阻碍到仪器的检测性能,其最高检测极限为10-22mol/L。
不同型号的仪器其检测技术不一样,但大体原理都是利用待测组份与体系的化学发光强度呈线性定量关系,而化学发光强度随体系反映进行的速度增强或虚弱。
记录仪记录峰形,以峰高定量,也能够峰面积定量。
因化学发光多为闪烁式发光(1—2s左右),故进样与记录时差短,分析速度快。
第二部份、化学发光经常使用的化学试剂及其原理
化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。
任何一个化学发光反映都包括两个关键步骤,即化学激发和发光。
因此,一个化学反映要成为发光反映,必需知足两个条件:
第一:
反映必需提供足够的能量(170~300KJ/mol),第二,这些化学能必需能被某种物质分子吸收而产生电子激发态,而且有足够的荧光量子产率。
到目前为止,所研究的化学发光反映大多为氧化还原反映,且多为液相化学发光反映。
化学发光反映的发光效率是指发光剂在反映中的发光分子数与参加反映的分子数之比。
关于一样化学发光反映,值约为10-6,较典型的发光剂,如鲁米诺,发光效率可达0.01,发光效率大于0。
01的发光反映极少见。
现将几种发光效率较高的经常使用的发光剂及其发光机理归纳如下。
1.鲁米诺及其衍生物
鲁米诺的衍生物要紧有异鲁米诺、4—氨基已基—N一乙基异鲁诺及AHEI和ABEI等。
鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化,发生化学发光反映,辐射出最大发射波长为425nm的化学发光。
在通常情形下鲁米诺与过氧化氢的化学发光反映相当缓慢,但当有某些催化剂存在时反映超级迅速。
最经常使用催化剂是金属离子,在专门大浓度范围内,金属离子浓度与发光强度成正比,从而可进行某些金属离子的化学发光分析,利用这一反映能够分析那些含有金属离子的有机化合物,达到很高的灵敏度。
第二是利用有机化合物对鲁米诺化学发光反映的抑制作用,测定对化学发光反映具有猝灭作用的有机化合物。
其三是通过偶合反映间接测定无机或有机化合物。
其四是将鲁米诺的衍生物如异鲁米诺(ABEI)标记到羧酸和氨类化合物上,通太高效液相色谱(HPLC)或液相色谱(LC)分离后,再在碱性条件下与过氧化氢-铁氰化钾反映进行化学发光检测。
也能够采纳其它分离方式,如将新合成的化学发光试剂异硫氰酸异鲁米诺标记到酵母RNA后,通过离心和透析分离,然后进行化学发光检测。
另外应用的还有N2(B2羧基丙酰基)异鲁米诺,并对其性能进行了研究。
2.光泽精
光泽精以硝酸盐的形式存在,在碱性介质中,过氧化氢将其氧化成四元环过氧化物中间体,而后裂解生成激发态的吡啶酮而发光。
利用光泽精与还原剂作用,可用于测定临床医学上一些重要的还原性物质,如抗坏血酸、肌酸酐、谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、乳糖、葡萄糖。
3.洛粉碱
洛粉是文献上记载最先的化学发光试剂,但却迟迟未取得应用,直到1979年Marino等人将它应用于Co的测定后才取得重视。
此试剂已被用于多种元素的分析测定。
4.过氧化草酸酯类
草酸盐类化学发光反映多数生成过氧草酰(Peroxalate)中间体,因此这种反映亦称过氧草酰类化学发光反映。
过氧草酸盐类化学发光分析应用的推行还有赖于新的荧光衍生试剂的开发。
5.吖啶酯类
McCapr等合成了一系列吖啶酯类化合物,对该类试剂的化学发光机理研究说明,发光效率与试剂中的可解离酸性基团的pKa有紧密关系,pKa一样应小于11。
吖啶酯类化合物是一类很有前途的非放射性核酸探针标记物,用作DNA的发光探针,发光量子产率高,稳固性好,标记物对杂交反映的动力学和杂交体的稳固性无阻碍,能够直接在碱性介质中进行化学发光反映。
以上五种化学发光剂化学发光量子产率高,水溶液稳固,能被多种氧化剂直接氧化而发光,也可被众多的金属高于催化发光反映而发光,许多无机、有机和生化组分也能增强或抑制其发光,因此应用十分普遍。
目前报导的有邻菲咯啉,碱基水杨酸、罗明丹—B、没食子酸、香豆素、皮素,茜素紫、苏木色精,培花青,三苯甲烷类染料,丙酮、乙醇、羟胺等。
这些试剂商品化程度高,价廉,利用方便,但化学发光量子产率较低,因此,研究增敏试剂来提高它们的化学发光量子产率是超级关键的。
第三部份 化学发光的应用
• 无机化合物化学发光分析
金属离子分析
痕量金属离子对化学发光反映具有专门好的催化作用,因此化学发光测定金属离子取得普遍的应用(见表1)。
可是,由于不同金属离子催化氧化发光试剂时,发光光谱相同,致使金属离子催化化学发光反映的选择性较差。
为提高分析的选择性,可采纳以下方式:
(1)利用待测金属离子与干扰离子配合物稳固性不同进行选择性分析,如加入掩蔽剂EDTA或水杨酸掩蔽干扰离子;
(2)优化实验条件以减少其它离子的干扰;(3)稀释样品溶液;(4)加入敏化剂。
可是,当样品中待测物相关于干扰物浓度很小时,上述方式也无济于事,只得进行前处置,经常使用的分离方式有色谱、溶剂萃取等。
色谱分离的高选择性与化学发光检测的高灵敏度相结合,是一种很有前途的联用技术。
关键是流动相的选择,流动相选择得好,不仅能够提高选择性,还能够进行多个离子的同时测定。
如用离子互换分离法同时测定Cr(à)和Cr(?
)。
溶剂萃取也是提高化学发光测定金属离子选择性的一个有效方式。
这种方式的要紧问题是费时,因为进行化学发光检测前必需将无机物从有机溶剂中反萃掏出来,或是将有机溶剂蒸发除去。
较好的方式是自动在线溶剂萃取选择性检测待测物。
其它无机化合物的分析
化学发光反映中,过氧化氢是最经常使用的一种氧化剂,因此有关H2O2化学发光分析的报导较多(见表2),涉及到鲁米诺、过氧草酸酯及光泽精等化学发光反映。
依照鲁米诺化学发光反映制成的H2O2光纤传感器与流动注射法联用,可检测10nmol/L~1mmo/L的H2O2,用模拟酶代替辣根过氧化物酶催化鲁米诺发光,检测限可达5.5×10-9mol/L。
依照ClO-对鲁米诺的氧化作用,可用于测定ClO-,其它物质如Cl2的干扰,可用流动注射法排除。
利用停流技术测定水中ClO-没必要进行前处置。
含氮的无机化合物如NH3/NH+4,可将其衍生后用TCPO化学发光法检测,线性范围为2。
9ug/L~6mg/L。
CN-能抑制鲁米诺H2O2-Cu(II)的化学发光,据此可分析测定CN—。
在低温条件下化学发光分析测定CN-,当进样量为100uL时,线性范围为10-9-10-7g/mL,当进样量20uL时,线性范围为10-8~5×10-7g/mL。
• 有机化合物的化学发光分析
有机酸
有机化合物的同系物结构和性质相似,使单一组分的测定碰到困难,因此有机化合物同系物的分析常与HPLC相结合。
有机酸的化学发光分析(见表3),一样是先将其衍生成荧光物质经色谱分离后进行化学发光检测。
但衍生法有如下的缺点:
(1)衍生反映不完全;
(2)衍生物稳固性差,要求及时检测;(3)限制了分离方式和条件的选择。
由于衍生产物的性质与待测物不同,致使分离效率和分辨率下降,同时增加分析的时刻和劳动强度。
在临床医学上,草酸是一个重要的检测项目,能够直接用氧化化学发光反映测定尿液和草酸二乙酯中的草酸盐及游离的草酸。
另外还能够测定苯酮尿症病人的尿液的苯丙酮酸的含量,方式是先在碱性条件下将苯丙酮酸氧化成1,22二氧杂环丁烷类化合物,然后裂解产生化学发光。
另外能够将Fe(III)草酸配合物光解取得Fe(II),催化鲁米诺-过氧化氢化学发光反映,此法线性范围为0.1~100uM。
另外酶联偶合反映也能够用于某些有机酸的化学发光分析。
有机碱
胺类化合物第一离子化电势呈如下规律:
伯胺>仲胺>叔胺,并随碳链增加,离子化电势慢慢下降,因此叔胺化合物的检测限较低,达0.28pM。
胺类化合物的分析(见表4),较多的是经柱前衍生生成荧光衍生物,分离后用过氧草酸盐化学发光体系检测,也可将其生成希夫碱或其它产物氧化而发光。
有些碱如肾上腺素等可直接氧化而发光。
通常有一个体会规那么,假设一物质具有荧光或其反映产物有荧光,该物质一样可发生化学发光反映,但也有例外。
嘌呤碱是核酸的基础物质,因此对嘌呤碱的分析测定将推动DNA分析方式的进展。
在酸性醇液中腺嘌呤与苯甲醛反映,然后用过氧化氢氧化反映产生化学发光,此法具有专门好的选择性,线性范围为1.5×10-7~5.0×10-7M,用此法测定鸟嘌呤灵敏度比荧光法高20倍。
氨基酸
氨基酸分析方式的改良有利于推动生物技术、基因工程、DNA重组和基因克隆等的进展。
由于绝大多数氨基酸没有内源荧光特性,因此用过氧草酸盐体系测定氨基酸需将其衍生成荧光物质,但此法幸免不了衍生法所固有的缺点。
另外亦可通过测定氨基酸与氨基酸氧化酶反映产生的过氧化氢来测定氨基酸的含量,如L2氨基酸经反相色谱柱分离后流经L2氨基酸氧化酶反映器产生过氧化氢,然后用过氧草酸盐体系检测。
氨基酸与Ru(bipy)3+3反映,用流动注射化学发光法检测,相关于脯氨酸和天冬酰胺检测限可别离达到20pmol和50pmol。
一样来讲,仲胺反映产生的的发光强度比伯胺大。
对氨基酸上取代基性质研究说明,给电子基有利于增强化学发光强度。
糖类
光泽精体系可用于测定一些还原性物质,如乳糖、葡萄糖,用于抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的分析测定有很高的灵敏度。
但此法用于复杂样品分析却因干扰多而受到限制。
用草酰胺化学发光照相法测定了葡萄糖。
在微量滴定板上将草酰胺发光剂、荧光增感剂及50uL试样混合,于5min内用照相荧光剂测定液斑的发光强度,可检出100pmol的萄萄糖。
糖类物质测定的另一个重要方式是测定酶反映产生的H2O2,由此对酶底物——葡萄糖、乳糖等进行测定。
而酶的固定化技术为此法的进展注入了新的活力。
采纳物理包埋法将葡萄糖氧化酶固定在聚丙烯酰胺凝胶中并制成酶柱,再将酶柱接入流动注射系统中,用流动注射化学发光法测定由酶促反映产生的H2O2,从而测定人体血液中的葡萄糖,检出限可达mg/L。
类固醇与类酯
一些特异性酶如类固醇脱氢酶和其它荧光素酶与适合底物反映产生H2O2,通过测定H2O2达到分析测定底物的目的。
药物
依照药物的不同类型选择不同的化学发光分析方式。
目前较经常使用的方式是直接氧化化学发光。
在碱性溶液顶用N-溴代丁二酰亚铵氧化含有酰胺基的药物产生化学发光,如利福霉素等检测限在1.23mg/L~0.5g/L之间。
氧化四环素类药物检出限在0.02-0.04mg/L之间。
3.化学化光在生物领域的应用
化学发光在生物学领域也有着很多应用,要紧简介如下:
Fe2+
离子催化的化学发光自由基启动的脂质过氧化(LPO)是一个链式反映进程。
在链式反映进程中,Fe2+离子起着启动和催化的作用。
反映进程中产生脂自由基(R-)、烷氧自由基(RO-)、共轭二烯和脂过氧化自由基(ROO-)等中间产物。
ROO-自反映会产生激发的烷氧自由基(RO3)和单线态氧(O2),其回到基态时产生发光。
另外,两个O2分子彼此作用也可产生发光。
因此,把Fe2+盐加入含有脂肪的系统中,如细胞膜、线粒体、微粒体、血浆、组织匀浆、尿液等,可产生化学发光。
化学发光的动力学曲线,可分为快速闪光期、暗藏期、缓慢发光期和稳固发光期。
有报告提出,快速闪光期的发光强度与样品中过氧化氢含量有关,暗藏期的长短与样品中抗氧化剂含量有关,而缓慢发光期和稳固发光期的发光强度那么反映了系统的过氧化水平,即系统产生活性氧的能力。
血浆和血清的化学发光
许多实验研究对加入Fe2+盐的不同疾病患者血浆和血清的化学发光进行的测量说明,与正常健康人相较,腹腔器官局部缺血、肢端闭合性局部缺血、血氧含量下降和出血、手术性休克病人血浆和血清的发光强度降低。
与此相反,风湿性关节炎、阑尾炎、胆囊炎、胰腺炎等炎性疾病患者血浆和血清的发光强度升高。
降低和升高的幅度与疾病的严峻程度有关。
有研究提出,利用此方式有可能对非典型的心肌梗塞和腹腔器官炎性疾病做出区别诊断。
血浆脂蛋白的化学发光
有研究提出,以分离的血浆脂蛋白悬液作为系统模型能够研究不同物质对系统过氧化的调剂机制。
在分离的血浆脂蛋白悬液中加入胆固醇,温育一按时刻后在加入Fe2+盐,测量化学发光,发觉胆固醇能使系统的发光强度降低。
分析以为,这可能是由于类固醇的存在抑制了系统的过氧化。
对实验性胆固醇过量血症家兔和动脉粥样硬化初期病人进行的测量发觉,载脂蛋白APO–B。
在Fe2+存在条件下的发光强度显现了增加。
一样的现象在肝硬化和慢性肝炎患者身上也被发觉。
尿液的化学发光
利用尿液的化学发光能够研究肾脏功能的转变。
将Fe2+盐加入尿液中,测量其化学发光,发觉肾功能不足者尿液的发光强度降低。
与正常健康人相较,阑尾炎患者尿液的发光强度那么有不同程度的提高。
利用这一方式能够评估肾脏的排泄及收缩功能。
物质抗氧化活性的测定
利用发光测量技术能够评判某些生物组织和体液的抗氧化活性。
以某一稳固的发光系统为模型,如脂肪体、线粒体、卵黄脂蛋白等,将待测的抗氧化物质加入该系统,然后加入Fe2+盐,测量其化学发光。
依照系统化学发光被抑制的程度能够评判物质的抗氧化活性。
利用这一方式进行的研究证明,不同疾病患者血浆和血清的抗氧化活性是不同的。
H2O2激发的化学发光
血浆和血清的化学发光
在血浆和血清中加入H2O2溶液后能激发化学发光。
有报告提出,发光强度与血浆中血红素的水平呈线性相关,相关系数为+0.71。
在上述发光系统中,加入过氧化氢酶或松香油后,发光被抑制,加入叠氮化钠(NaN3)后,发光几乎完全消失。
H2O2激发的血浆和血清的化学发光,其启动因素极可能是血红素过氧化物酶催化H2O2分解引发的。
血红素过氧化物对H2O2的分解是以H2O2氧化其底物为前提的。
在这一反映进程中致使自由基及其中间产物生成,并与机体分子彼此作用,产生O2等活性物质,产生发光。
NaN3和松香油是O2的抑制剂,因此在上述发光系统中加入松香油的NaN3后,发光被抑制。
血液中血红素过氧化物酶等以自由基方式分解H2O2,而过氧化氢酸那么以非自由基方式分解H2O2,生物体内这两类反映体系协同作用,能专门好的清除细胞内的H2O2。
病理条件下,这一反映体系的平稳被破坏,H2O2激发的化学发光强度将发生相应改变。
因此,依照血浆和血清化学发光的转变,有可能对某些疾病进行区别诊断。
红细胞的化学发光
1981年Cepгиеко等人在分离出的红细胞悬液中加入H2O2溶液,对其化学发光进行测量。
发觉,随着红细胞的老化和溶解,系统发光强度呈增加趋势。
随后对实验性动脉粥样硬化家兔红细胞化学发光进行的测量发觉,与正常对照组相较,发光强度显现了降低。
这可能是由于细胞膜中胆固纯含量太高造成的。
对恶性肿瘤患者的调查也发觉发光强度的改变。
红细胞的衰老与脂质过氧化有关。
H2O2能引发膜脂过氧化,H2O2和脂质过氧化产物都能引发血红蛋白释放Fe2+,Fe2+是诱发一系列自由基反映、起动脂质过氧化的催化剂。
自由基的产生不仅增进了红细胞的衰老和溶解,而且引发的脂质过氧化还能够致使膜脂组分和结构的改变,直接阻碍红细胞的生理功能。
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